凡是来源于胚胎、组织器官及外周血，经特殊分离方法制备而来的原初培养的细胞称为原代细胞。原代细胞培养是生物学研究和医学研究中常用的技术，它可以帮助我们更深入的了解细胞的生物学行为、疾病机制等。

一、取材

  1、组织来源

  物种来源：根据实验目的选择人、大鼠、小鼠等不同物种的组织。

  组织类型：优先选择新鲜、健康的组织（如胚胎组织、幼体组织，因其细胞增殖能力强），去除无用组织，避免干燥。

  无菌取材：解剖时需严格无菌操作，避免微生物污染、机械损伤。

  2、各类组织的取材技术

  皮肤和粘膜：主要取自于手术过程中的皮片，方法类似于外科取断层皮片手术操作，面积一般为2 cm²-4 cm²。

  血液：血细胞、淋巴细胞的的取材，一般多抽取静脉外周血，或从淋巴组织中（如脾、扁桃体、胸腺、淋巴结等）分离细胞，取材时应注意抗凝。

  内脏和实体瘤：内脏取材时应明确和熟悉所需组织的类型和部位；实体瘤取材时要取肿瘤细胞丰富的区域，避开破损、坏死、液化部分，尽量去除混杂的结缔组织。

二、分离和制作

  1、机械分离法

  将组织剪碎至1 mm³-3 mm³小块，用无菌筛网（100目-200目）过滤去除纤维碎片，离心（800 rpm -1000 rpm，5 min）收集细胞悬液。适用于较坚韧的组织（肿瘤、软骨等）。

  2、消化分离法

  消化分离法常用胰蛋白酶、胶原酶、透明质酸酶，将组织剪碎后浸泡于含酶的消化液（37℃预热），37℃振荡消化15 min-30 min（时间依组织类型调整），加入含血清的培养基终止消化（血清可抑制酶活性），离心（1000 rpm，5 min）后重悬细胞。

三、原代细胞培养

  1、贴壁细胞

  细胞接种时通过PBS缓冲液充分漂洗，尽量去除消化液，密度约为1×10⁵cell/mL -1×10⁶cell/mL，接种于培养瓶，初次培养时可保留部分组织块贴壁（组织块法可促进细胞迁出）。基础培养基使用DMEM、RPMI 1640或MEM（根据细胞类型选择），添加10%-20%胎牛血清及必要的生长因子（如EGF、bFGF用于干细胞），37℃、5% CO₂培养。

  起始48 h中尽量减少振荡，防止刚贴壁的细胞发生脱落，漂浮；待细胞基本贴壁伸展并逐渐形成网状，应将原代细胞换液；用骨髓或外周血中的悬浮细胞经静置培养7 d时，应将细胞悬液经低速离心后换液。

  2、悬浮细胞

  原代培养时应尽量去除红细胞，长期培养时，淋巴细胞中要加入生长因子，白血病细胞中加入少量的原患者血清，维持细胞生长。细胞换液一般每隔3 d半量换液一次。

四、注意事项

  原代细胞的分离和培养过程需要特别注意无菌操作和细胞的养护，以保证细胞的健康和活性。

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