微生物菌种是生物医药、食品工业、环境修复等领域的核心资源。科学规范的菌种保存与管理不仅能确保其遗传稳定性与功能活性，还可为科研数据的可重复性和工业生产的一致性提供保障。随着生物技术的快速发展，菌种保存技术不断革新，但实验室与工业场景中仍面临保存方法选择不当、菌种污染、活性衰减等问题。本文整合了菌种保存、使用及限用时间管理的全流程技术要点，并结合前沿技术展望，为从业者提供系统性指导。

一、菌种保存的核心原则与技术分类

1、保存原则

  菌种保存需围绕以下核心目标展开：维持遗传稳定性，避免基因突变或表型漂变；确保高存活率，通过环境控制减少细胞损伤；延长保存周期，根据需求选择短期、中期或长期保存方案。

菌种保存的基本原则包括：低温抑制代谢（-20℃至-196℃），脱水减少冰晶损伤（如冻干法），隔绝氧气延缓氧化（液体石蜡覆盖），营养限制降低代谢速率（贫营养培养基）。

2、保存技术分类

  根据保存时长与适用场景，菌种保存方法可分为三类：短期保存（≤6个月），如斜面低温法；中期保存（1-10年），液体石蜡法、甘油管冷冻法、冻干法、瓷珠吸附法；长期保存（≥10年），液氮超低温法。

二、菌种保存技术详解

1、斜面低温保存法

  （1）步骤：接种菌种至斜面培养基，37℃培养至对数生长期；密封后4℃±1℃避光保存。

  （2）适用菌种：大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌等常温菌。

  （3）优点：操作简单，无需特殊设备，适合实验室日常使用；菌种活性恢复快，便于频繁取用；成本低廉，仅需普通冰箱即可完成保存。

  缺点：保存周期短（1-3个月），需频繁传代；易受污染或发生表型变异；培养基易干裂，需定期检查密封性。

  （4）注意事项：每月转接一次，避免培养基干裂；添加磷酸盐缓冲液可延缓代谢产酸。

2、液体石蜡覆盖法

  （1）操作：无菌石蜡油覆盖斜面，油层厚度≥1 cm，直立保存。

  （2）适用菌株：兼性厌氧菌和酵母菌。

  （3）优点：隔绝氧气，保存期延长至6-12个月；成本较低，仅需灭菌液体石蜡。

  缺点：不适用于严格厌氧菌（石蜡渗透可能阻碍气体交换）；石蜡层过薄可能导致培养基脱水；复苏时需清除石蜡残留，操作繁琐。

3、甘油管冷冻法

  （1）配方：20%-40%甘油与菌悬液（OD600≈1.0）混合，分装后-80℃保存。

  （2）优点：适用范围广（细菌、真菌、放线菌）；保存期长（2-5年），年均存活率下降仅1%-2%；复苏便捷，可直接划板接种。

  缺点：依赖-80℃超低温冰箱，设备成本较高；反复冻融会导致菌种活性显著下降；高浓度甘油可能抑制部分菌种生长。

4、冷冻干燥法（冻干法）

  （1）核心工艺：菌体与保护剂（10%脱脂乳或海藻糖）混合；预冻至-50℃以下；真空干燥（0.1 mbar-1 mbar，24 h-72 h）。

  （2）优点：保存期长达5-15年，存活率≥70%；菌种代谢完全停滞，遗传稳定性高；便于运输和长期保藏（如标准菌株库）。

  缺点：设备昂贵（需冻干机、真空泵等）；操作流程复杂，预冻与干燥时间长达24 h-72 h；对部分脆弱菌种（如某些古菌）存活率较低。

5、瓷珠保藏法

  （1）步骤：菌悬液吸附于无菌瓷珠，冷冻保存；复苏时取单颗瓷珠接种。

  （2）优点：单次分装多颗瓷珠，避免反复冻融；高通量管理，适合大规模菌种库；复苏便捷，直接取单珠接种。

  缺点：初期需购置专用瓷珠和分装设备；吸附效率受菌悬液浓度影响；长期保存需依赖超低温设备（-80℃或液氮）。

6、液氮超低温保存

  （1）程序：梯度降温（1℃/min）至-196℃，保护剂为5%-10% DMSO或甘油。

  （2）优点：保存期最长（≥10年），存活率几乎无衰减；适用于所有微生物类型，包括极端嗜热/嗜冷菌；细胞代谢完全停滞，避免遗传变异。

  缺点：液氮罐维护成本高，需定期补充液氮；操作风险大（液氮泄漏或冻伤）；梯度降温程序复杂，需专业培训。

  （3）注意事项：需定期补充液氮，避免温度波动＞5℃。

三、菌种复苏方法

1、斜面低温保存菌种

  （1）步骤：从4℃冰箱取出斜面菌种，检查密封性及培养基状态（无干裂、污染）；用接种环无菌挑取少量菌苔；划线接种至新鲜固体培养基；按菌种生长条件（如37℃）培养18-24小时，观察菌落形态。

  （2）注意事项：若斜面干燥或菌苔稀疏，需延长培养时间或重新活化；避免多次挑取同一斜面，防止污染。

2、甘油管冷冻菌种（-80℃）

  （1）步骤：从超低温冰箱中取出冻存管，迅速置于37℃水浴中摇晃解冻（≤2分钟）；用无菌吸管吸取50 μL-100 μL菌液，直接划线接种至固体培养基；剩余菌液可短期保存于4℃（≤24小时），避免反复冻融。

  （2）注意事项：快速解冻：缓慢解冻易导致冰晶损伤细胞；梯度稀释法：若菌液浓度过高，需用无菌生理盐水稀释后接种（如10-1至10-3梯度）。

3、冻干菌种

  （1）步骤：无菌环境下开启冻干管（火焰灼烧管口或使用专用开瓶器）；加入0.5 mL-1 mL适宜液体培养基（如TSB）或复苏液（含0.1%蛋白胨）；轻摇使菌粉充分溶解；取100 μL菌悬液划线接种至固体培养基，剩余液体可短期保存于4℃。

  （2）注意事项：复苏液选择：优先使用菌种原始培养基成分；避免震荡：剧烈摇晃可能损伤复苏细胞。

4、瓷珠保藏菌种

  （1）步骤：从-80℃冰箱中取出瓷珠管；用无菌镊子夹取1颗瓷珠，直接滚动接种至固体培养基；剩余瓷珠立即放回低温保存，避免反复冻融。

  （2）注意事项：无需解冻：瓷珠可直接接种，减少复苏时间；吸附效率：若菌量不足，可同时使用多颗瓷珠。

5、液氮超低温保存菌种

  （1）步骤：佩戴防冻手套，从液氮罐中取出冻存管（避免直接接触液氮）；迅速转移至37℃水浴中快速解冻（≤1分钟）；用75%酒精擦拭冻存管外壁消毒；无菌条件下打开管盖，吸取菌液接种至预还原培养基（厌氧菌需在厌氧工作站操作）。

  （2）注意事项：梯度降温菌种：若采用程序降温，需按原降温速率反向复温（需专用设备）；严格无菌：液氮可能被微生物污染，需彻底消毒管壁。

四、通用复苏注意事项

  1、无菌操作：全程在生物安全柜或酒精灯火焰附近操作；冻存管开启前需酒精消毒表面。

  2、温度控制：冷冻菌种需快速解冻，避免冰晶重结晶损伤细胞；嗜冷菌复苏温度应匹配其生长需求（如4℃-15℃）。

  3、培养基选择：优先使用高营养培养基（如TSA、LB），促进菌种快速增殖；特殊菌种需添加生长因子（如血红素、维生素）。

  4、复苏后处理：初次复苏菌种需连续传代2-3次，恢复代谢活性；严格记录复苏日期及代数，避免超代使用。

  5、传代次数限制：标准菌株≤3代，生产菌种≤5代，每代需进行功能验证。

五、保存期限影响因素与限用时间管理

1、保存方法差异

2、限用时间确定原则

  （1）菌种特性：易变异菌种（如病毒）限用时间≤6个月，稳定性菌株（如枯草芽孢杆菌）可延至2年。

  （2）保存条件：4℃保存的限用时间为冷冻保存的1/3。

  （3）使用频率：高频率使用菌种建议缩短至原期限的50%。

3、失效判定与处置

  （1）质控红线：存活率＜10³ CFU/mL、传代次数超限、表型变异率＞5%。

  （2）异常处理：污染菌种立即销毁，活性丧失需重新复苏备份。

六、相关产品

1、部门斜面产品

2、部分瓷珠菌种产品

3、部分冻干质控菌株产品

注:本文属海博生物原创,未经允许不得转载。