一、复苏前准备
1、信息核对
  确认菌株名称、编号、保存形式（冻干粉/磁珠/甘油管）及供应商说明书要求。
2、培养基配制
  使用非选择性琼脂培养基（如TSA、营养琼脂）进行首次复苏，避免液体培养基导致污染风险。
  特殊菌株需专用培养基（如副溶血弧菌用3% NaCl碱性蛋白胨水预增菌）。

二、复苏操作步骤
1、冻干粉菌株：
  消毒与外包装开启：用75%酒精棉擦拭西林瓶表面，按铝盖箭头方向开启胶塞。
2、复水活化：

  加入0.3~0.5mL配套液体培养基（如脑心浸液），轻摇溶解冻干粉成悬液。
3、接种培养：

  用无菌接种环蘸取悬液，在琼脂平板分区划线（便于观察单菌落）。或取50μL悬液涂布平板，标记菌株信息及日期。
4、磁珠或甘油冷冻菌株
  解冻处理
  （1）磁珠保存：室温解冻后，用接种环挑取单颗磁珠在平板滚动接种。
  （2）甘油冷冻：37℃水浴快速解冻（≤30秒），避免反复冻融。
  接种方式
  解冻菌液直接划线接种至平板，或取10~20μL涂布。

三、特殊菌株处理
  副溶血弧菌/创伤弧菌：需先用3% NaCl碱性蛋白胨水37℃预增菌8~12小时，再转接琼脂平板。
  厌氧菌或营养缺陷菌：添加生长因子（如血清、半胱氨酸），并在厌氧罐中培养。

四、复苏后验证
1、培养观察：

  37℃倒置培养24~48小时，未生长则延长至72小时。检查菌落形态均一性（大小、颜色、边缘）。
2、纯度与特性确认：

  革兰氏染色镜检观察菌体一致性。生化反应鉴定（如氧化酶、糖发酵试验）或分子方法验证。
3、短期备份：

  挑取单菌落接种斜面或肉汤，制备甘油冷冻管（-80℃保存）作为工作菌株储备。

五、关键注意事项
1、代数控制：

  冻干粉菌株（F0代）传代≤5代，磁珠/甘油菌株传代≤3代。
2、避免污染：

  操作全程在生物安全柜中进行，废弃物料121℃高压灭菌30分钟。
3、特殊菌株警示：

  对低温敏感的菌株（如弧菌属）禁止直接划线，必须预增菌。
4、操作要点总结：

  严格无菌操作、匹配菌株特性培养基、控制传代数、复苏后必验证！

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