在分子生物学、医学诊断和生命科学研究的众多强大工具中，实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，简称qPCR）无疑是一颗璀璨的明珠。它不仅仅是一种高效、灵敏的核酸（DNA或RNA）检测技术，更因其精确定量的能力，成为了现代生命科学领域不可或缺的基石技术。

一、原理

  荧光定量PCR技术作为一种革命性的分子生物学工具，已经在基因表达分析、病原体检测和药物研发等多个领域展现出其无可比拟的优势。其基本概念源于传统的PCR反应，但通过引入荧光信号检测系统，实现了对PCR扩增过程的实时监控和定量分析。PCR反应的基本步骤包括模板DNA的变性、引物与模板的退火以及引物延伸三个主要阶段，这些步骤在荧光定量PCR仪中通过精确控制的温度循环得以高效执行。

  实时荧光定量PCR是一种在PCR扩增过程中，通过荧光信号对模板DNA或RNA进行实时监测并精确定量的技术。传统PCR只能在反应结束后通过电泳来粗略估算产物量不同，而qPCR可以在反应过程中实时看结果。qPCR的“实时”和“定量”是其核心优势，实时（Real-time）是指在每一轮PCR扩增循环中，系统都会同步检测并记录荧光信号的强度，实现了对反应过程的全程监控。定量（Quantitative）是通过对荧光信号增长曲线的分析，可以精确计算出起始模板的浓度，真正实现了从“有没有”到“有多少”的飞跃。

  在扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，这样的直线即是基线，这条线可以自动生成也可以手动设置。之后反应会进入指数增长期，这个期间扩增曲线具有高度重复性，在该期间，可设定一条荧光阈值线，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般会将荧光阈值的缺损设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数被称为Ct值，这个值与起始浓度的对数成线性关系，且该值具有重现性。起始模板浓度越高，达到荧光阈值所需的扩增循环次数就越少，即Ct值越小。起始模板浓度越低，达到荧光阈值所需的扩增循环次数就越多，即Ct值越大。

  Ct值最大的意义就是用来计算目的基因的表达量，此时就有两个概念容易被提及，那就是绝对定量和相对定量，绝对定量的目的是测定目的基因在样本中的分子数目，即通常所说的拷贝数。相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例，而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。Ct值可以被用来计算这两种定量结果，但是绝对定量实验必须使用已知拷贝数的绝对标准品，必须做标准曲线。相对定量可以做标准曲线，也可以不做标准曲线。绝对标准品制作困难难以获取，实验室基本都是选择相对定量的方法来计算相对基因表达量。

二、基于荧光化学原理分类

  基于荧光化学原理分类是最核心和常见的分类方式，根据荧光信号产生的机制，主要分为非特异性染料法和特异性探针法两大类。

1.非特异性染料法

  非特异性染料法使用一种能与所有双链DNA（dsDNA）小沟结合的荧光染料。代表染料：SYBR Green I。SYBR Green I是一种可以在PCR循环过程中随着PCR产物的累计而对其进行检测的高度特异性双链DNA结合染料。SYBR Green I染料试剂可以检测所有双链DNA，包括非特异性的反应产物。因此这样经过特别优化的反应体系，对于获取准确的结果而言是非常必要的。

  工作原理是该染料本身具有微弱的荧光。当它与PCR反应中产生的双链DNA产物结合后，荧光信号会急剧增强（可增强1000倍以上）。首先，在扩增的起始阶段，经过热变形双链DNA发生解链变成单链，染料结合不上去，因此就没有荧光信号。随着反应的进行，有双链形成之后，染料就会结合在双链形成的小沟上。每形成一个DNA双链，就有一定数量的染料结合上去；染料一结合，就产生荧光信号；信号强度与DNA分子总数目成正比。那么在PCR的每一个循环中这种荧光信号的积累过程就能被仪器所实时监控。

  此种方法具有成本低廉，只需设计普通引物，无需昂贵的荧光探针。设计简便，适用于任何基因，只需知道序列即可设计引物。灵敏度高等优点，但是此方法特异性较差，染料会与任何双链DNA结合，包括引物二聚体和非特异性扩增产物，可能导致假阳性信号和定量不准确。总体来说非特异性染料法经济快捷，但需要精心优化引物和反应条件，并且必须做熔解曲线分析来确保特异性。

2.特异性探针法

  特异性探针法通过采用荧光探针在PCR循环过程中随着特定PCR产物的累计而对其进行检测。通过引入基于Taq DNA聚合酶5’核酸酶活性的荧光标记探针，实时定量PCR系统得到了显著提升。这些荧光探针的使用，使得实时定量的方法得到了发展，实现了仅对特定扩增产物的检测。此外，荧光标记探针的开发，也免去了用于探针降解分析的PCR反应后处理过程。

  工作原理是PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。开始时，探针完整地结合在DNA任意一条单链上，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，检测不到荧光信号；PCR扩增时，Taq酶将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每经过一个循环，就会有更多的报告基因染料分子从各自的探针上切断，荧光强度会随着合成的扩增片段数量的增加而增加。

  此种方法需要在探针和目标分子（靶点）之间发生特异性的水解（杂交），方可生成荧光信号，可使用明显不同的报告基因染料标记探针，在一个反应管内扩增并检测两个不同的序列，并且无需PCR后处理，减少分析工作量并节省材料成本。但是需要根据不同的序列，合成不同的探针。

三、应用

  1. qPCR技术在感染性疾病诊断领域展现出显著的技术优势，其核心价值在于突破传统病原学检测的局限性。对于培养周期冗长（如结核分枝杆菌）或缺乏标准化检测体系的病原体（如新型突发传染病原），该技术通过特异性引物/探针设计，可实现单拷贝级核酸的精准扩增与定量分析。

  相较于免疫学检测方法，qPCR有效规避了“诊断空窗期”问题，动态监测能力，通过实时追踪病毒载量变化，可区分急性感染期与病毒携带状态。隐性感染识别，基于核酸扩增信号，可检出免疫学标志物（如抗原/抗体）尚未阳转的亚临床感染阶段。在抗体检测无法明确感染时相的场景中，qPCR通过直接检测病原体核酸，为现症感染判定提供分子证据。该技术已成功应用于多类病原体的临床检测体系：①病毒检测，乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒等，覆盖病毒载量监测与耐药突变分析。②细菌/寄生虫检测，淋球菌、结核分枝杆菌、梅毒螺旋体、弓形虫等，解决传统培养法耗时长的痛点。③非典型病原体检测，肺炎支原体、衣原体、沙眼衣原体等，突破血清学诊断的窗口期限制。

  2. qPCR技术已成为解析癌基因异常表达与遗传学变异的核心工具。尽管肿瘤发病的机理尚未清楚，但相关基因发生突变是致癌性转变的根本原因已被广泛接受。癌基因的表达增加和突变，在许多肿瘤早期就可以出现。qPCR不但能有效地检测到基因的突变，而且可以准确检测癌基因的表达量。目前用此方法进行过端粒酶hTERT基因、慢性粒细胞性白血病WT1基因、肿瘤ER基因、前列腺癌PSM基因、肿瘤相关的病毒基因等多种基因的表达检测。

  qPCR技术通过以下维度深化肿瘤研究：

  ①早期诊断与分型。检测癌基因特异性表达产物，如CD44变异剪接体（CD44v）在泌尿系肿瘤中的表达特异性达98.6%。融合基因鉴定，BCR/ABL融合转录本检测对慢性髓系白血病（CML）的诊断特异性达100%，灵敏度较细胞遗传学分析提升2个数量级。

  ②预后评估与治疗监测。微量残留病灶（MRD）检测，通过BCR/ABL/ABL1比值（IS-MRD标准）动态监测，可预测CML患者停药后分子学复发风险。耐药机制解析，定量检测MDR-1基因表达水平，指导化疗方案优化。

  ③分子标志物开发。构建多基因表达谱，联合检测RAS/RAF/MAPK通路关键节点基因在结直肠癌中的表达模式。表观遗传学研究，通过甲基化特异性FQ-PCR（MSP-PCR）解析MGMT启动子甲基化状态与胶质瘤替莫唑胺耐药性的关联。

  qPCR技术体系通过单细胞水平基因表达解析（如检测单个循环肿瘤细胞CTCs的HER2 mRNA表达），为肿瘤异质性研究及个体化治疗策略制定提供了关键技术支撑。

  3. 基因表达差异分析比较是经过不同处理样本之间特定基因的表达差异（如药物处理、物理处理、化学处理等），特定基因在不同时相的表达差异以及cDNA芯片或差显结果的确证。

  qPCR技术在遗传病临床转化领域的历史性突破，始于对镰状细胞贫血症及α-地中海贫血相关基因突变的分子诊断。历经数十年技术迭代，该技术已实现从基础研究向临床实践的跨越式发展：在检测谱系方面，可覆盖已知序列遗传病的点突变、基因缺失及表达量异常等多种分子病理类型；在检测灵敏度层面，已突破单细胞水平的目标基因扩增阈值，为植入前遗传学诊断（PGD）提供了关键技术支撑。

  特别值得注意的是，基于多色荧光标记探针的实时定量PCR平台，通过等位基因特异性扩增策略，可精确区分目标位点的纯合突变与杂合突变状态。该体系在复杂疾病研究领域已建立标准化检测流程，典型应用包括胰岛素受体基因突变分析、载脂蛋白E（ApoE）基因多态性检测等，为单基因遗传病的分子分型提供了高分辨率解决方案。

  4. 产前诊断。人们对遗传性物质改变引起的遗传性疾病还无法治疗，到目前为止，还只能只能通过产前监测，减少病婴出生，以防止各类遗传性疾病的发生，如为减少X连锁遗传病患儿的出生，从孕妇的外周血中分离胎儿DNA，用实时荧光定量PCR检测其Y性别决定区基因是一种无创伤性的方法，易为孕妇所接受。

  5. 免疫表型分析是解析机体免疫应答机制的核心环节，其中T细胞受体（TCR）Vβ亚家族的定量分析已成为评估免疫稳态的重要生物学标志。传统流式细胞术受限于抗体谱系覆盖率，而基于qPCR的技术革新为该领域提供了新范式。1997年Lang等研究者建立的改良方案，通过引入荧光共振能量转移（FRET）探针系统，创新性地将下游引物与检测探针共价偶联，构建了多通道并行检测平台。该体系针对不同Vβ亚家族设计特异性上游引物，通过实时监测扩增曲线的荧光信号特征，实现了单管反应体系内多个免疫表型的绝对定量分析。

  实时荧光定量PCR如同一把高精度的“分子尺”，通过荧光信号和Ct值动态、精确地测量微观世界中的核酸数量，成为从基础科研到临床诊断等多个领域不可或缺的黄金标准工具，持续推动着科技进步和人类健康事业的发展。

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