一、引言

  真菌孢子悬液在科研、生产和检测多个领域都有使用。特别是在微生物实验室的质量控制中，作为标准质控样品，验证真菌检测培养基的性能、人员操作的准确性，保障实验结果的可靠性都有使用。

  怎样制作出均匀且满足要求的孢子悬液是很多实验人员困惑已久的问题。本文主要针对这一难题展开讨论，保证更多的实验人员能制成均一可用的真菌孢子悬液，用于后续的实验。

二、前期准备

    1、提前将目标真菌接种到PDA平板上（也可使用特定的产孢子培养基，如产孢子培养基，25℃-28℃恒温培养7天-10天，待平板表面形成浓密、完全成熟的孢子层，无肉眼可见的杂菌污染。

    2、提前配制含0.05%吐温-80的无菌生理盐水，121℃高压灭菌后冷却备用，吐温-80可有效降低孢子团聚，避免形成大颗粒菌团。

    3、准备无菌涂布棒、移液枪、无菌脱脂棉、无菌注射器、涡旋振荡器、血球计数板等工具，全部提前灭菌处理。

三、核心制备步骤

    1、洗孢子 

    向长满孢子的平板中，加入5 mL-10 mL无菌吐温-生理盐水，用无菌涂布棒轻轻刮取平板表面的孢子层，全程避免刮破培养基，防止混入琼脂碎片。

    2、混匀孢子

    将平板内的孢子悬液转移至无菌离心管，置于涡旋振荡器上振荡3分钟-5分钟，充分打散团聚的孢子，让孢子完全分散成单个状态。

    3、过滤孢子

    取一支空的无菌注射器，在注射器筒身中部塞入一小团提前灭菌的疏松脱脂棉，将粗孢子悬液从注射器上端倒入，依靠重力自然流下，脱脂棉会牢牢拦截菌丝碎片，滤液就是分散均匀的纯孢子悬液，适配小体积样品快速过滤。

    4、计数孢子

    取少量滤液用血球计数板计数，根据实验需求，用无菌生理盐水将悬液稀释至目标浓度（通常为1×106个/mL-1×107个/mL）。

四、优化细节

    若需更高纯度的孢子悬液，可将粗滤液在4℃下3000 rpm离心5分钟，弃去上层清液后重悬沉淀，重复2次即可去除大部分残留菌丝。

    制备完成的孢子悬液建议2小时内使用，4℃冷藏存放不超过24小时，避免孢子萌发影响活性。

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