培养法最为可靠且成本低廉，但培养周期较长。常用于细胞以及I临床治疗细胞的支原体检查。 
1、所需仪器设备及培养基 
（1）仪器设备：培养箱，显微镜。 
（2）培养基  
①支原体肉汤培养基。 
②精氨酸肉汤培养基。 
③支原体琼脂培养基。 
2、检查方法 
（1）样品的贮存：样品如在24h以内进行支原体检测，则可贮存在2—8℃；如果超过24h，样品应放置于-20℃以下保存。 
（2）检查支原体：采用支原体琼脂培养基（半流体）。将样品分别接种10ml半流体培养基（已冷至36℃），每支培养基接种样品0.5—1.0ml，至36℃培养21d，每隔1d观察一次。 
3、结果判定：培养结束时，在琼脂培养基中能看到典型的“彗星状”和“油煎蛋”状菌落出现。如已接种培养基均无支原体生长，则检测样品合格。如果怀疑有支原体污染，可取加倍量样品复试，如果没有支原体生长，则可视为合格，否则为不合格。