各种接种技术和细菌生长状况观察

2010-11-16 10:06:51 青岛海博

1. 学会正确使用微生物学实验室中常用的接种工具，掌握各种接种技术。
2.  掌握无菌操作技术和获得微生物纯培养物的方法。
3.  学会判断细菌在不同培养基上的生长状况。
一、常用接种工具
（一）接种环
接种环是用金属丝做成的。使用前后均应在火焰上彻底灼烧灭菌，灭菌时右手持接种环（或接种针）之木柄，将铂丝直立于火焰中，渐渐下移使铂丝烧红，并将铂丝和木柄之间的金属捧也通过火焰数次。取菌时，必须待接种环（针）冷却后方可使用。
（二）接种针
灭菌处理基本上同接种环。
（三）吸管
微生物学实验一般使用刻度到底的吸管，须进行无菌操作时，事先塞少许棉花于吸管上端管口内，然后把吸管置于金属筒中或用纸条缠包起来，干热灭菌后方可使用。
（四）微量移液器
可调微量移液器外形如图实验-7所示，主要部件有按钮、弹簧、活塞和可装卸的滴头（tip）。按动按钮，使弹簧上下活动，可在10～1000μl之间定量吸放液体。滴头可一次性使用，方便省事。
二、各种培养基的接种方法
培养物往新的培养基上移植，叫做接种。根据目的不同可分别采用接种环、接种针、移液管等进行斜面接种、液体接种、半固体穿刺接种和琼脂平板划线分离等。
    “无菌”是保证微生物实验室工作成功的前提条件，要做到这一点就得使用无菌的材料、器皿和采用无菌操作技术。无菌操作技术主要是防止外界环境微生物污染实验材料、破坏实验微生物的纯培养状态，同时也要防止实验材料污染环境或感染人体。因而要求：① 工作环境需用消毒液处理； ② 接种工具必须严格无菌。
1．实验材料
（1）菌种
金黄色葡萄球菌斜面培养物，大肠埃希菌斜面培养物和液体培养物，枯草杆菌斜面培养物，藤黄八叠球菌斜面培养物，链球菌培养物，混合的细菌菌种（金黄色葡萄球菌与大肠埃希菌）。
（2）接种工具
接种环，接种针，无菌吸管，酒精灯。
（3）培养基及其它
琼脂斜面培养基，试管肉汤培养基，半固体培养基，琼脂平板培养基，琼脂高层培养基，无菌平皿等。
2．实验方法
（1）斜面培养基接种法
a．左手持菌种管与培养基管，斜面皆向上，菌种管在外侧，右手如拿毛笔的姿势持接种环，将铂丝与欲进入试管的柄部通过火焰灭菌。
b．右手的小指与掌心夹下培养基管棉塞，第四指与小指夹下菌种管棉塞，管口通过火焰。
c．接种环伸入菌种管，沾取少许菌种。
d．接种环伸入培养基管，在斜面上蜿蜒划线。注意沾有菌种的接种环不可碰管口与其它地方。
e．管口再通过火焰，并将棉塞塞于原来的试管。
f．   接种环再灭菌。
（2）液体培养基接种法
基本上与斜面培养基接种法相同，不同之处是，将挑取的菌种移种至液体培养基管中时，斜持试管，将菌涂于液面处管壁上，试管直立以后菌种即在液体内。
用接种环分别挑取金黄色葡萄球菌斜面培养物、枯草杆菌斜面培养物、大肠埃希菌培养物，接种于肉汤培养基中，每菌接种1支。将已经接种好试验菌的各管置于37℃恒温箱培养24~48h。观察上述各菌在液体培养基中的生长状况。
（3）半固体培养基接种法
半固体培养基接种时应用接种针，接种针使用方法基本同接种环。接种时，将沾取菌种的接种针从半固体培养基表面向下穿刺，但不触及管底，接种针循原路抽出。此称为“穿刺接种法。
分别接种金黄色葡萄球菌、枯草杆菌至半固体培养基中，放入37℃恒温箱中培养24h后观察它们的生长状况，判断它们是否具有动力。
（4）琼脂平板划线分离法
平板划线有多种方法，其目的都是要将细菌分开，培养后可观察单个菌落的特征。若挑取单个菌落移种至另外的培养基中，培养后即得纯培养物。现介绍常用的平行划线法及分区划线法。
（1）平行划线法
将接种环灭菌后，从菌种管沾取少许菌种，涂于平板培养基表面一端的边缘处，再将接种环灭菌，以杀死过多的细菌。从涂有细菌处开始做往返平行划线，若从液体培养物取菌或从斜面培养物取少量菌，估计分离出单个菌落时，取菌后可直接从平板一端向下划平行线，可不必再将接种环灭菌。
分别取大肠埃希菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄八叠球菌的少许菌苔，在不同的无菌平板上通过分区划线或平行划线进行划线分离。划线后的平板在37℃恒温箱中倒置培养24~48h。取出平板，从以下几个方面来观察不同细菌的菌落：
大小：以毫米计。
形状：圆形、不规则形、放射状等。
表面：光滑、粗糙、圆环状、乳突状等。
边缘：整齐、波形、锯齿状等。
色素：有无色素、颜色，是否可溶（可溶色素使培养基着色）等。
透明度：透明、半透明、不透明。
（2）分区划线法
如图实验-11所示，用接种环将所取菌种先划线于a处。将接种环灭菌，从a处将菌划出至b处。接种环再次灭菌后，从b处划出至c处，依次类推，以达到培养后能获得单个菌落的目的。

（5）倾注平板法
本法常用于细菌总数、细菌对药物的敏感度试验以及药物的含量测定等。倾注平板的常用的操作方法有两种：
a．液混入培养基法
用无菌吸管吸取定量菌液，加入已熔化并冷却至约50℃的琼脂培养基中，迅速混匀，倒入无菌平皿，使均匀布满皿底。平置勿动，凝固后即成含菌平板。此法细菌分布均匀，药物的抑菌试验（药敏试验）多用此法制备含菌平板。
b．菌液先加入平皿法
以无菌吸管吸取定量菌液或其它含菌样品，加入无菌平皿中，再将熔化并冷至约50℃的无菌琼脂培养基倾入该平皿中，立即将平皿轻轻地作旋转晃动，以使菌液与培养基混合均匀，平置待凝固。计算药品、食品等样品中细菌总数时常用此法。因为是将定量样品直接加入平皿中，所以菌数较准确。