生物指示剂验证总是在灭菌设备的初始性能确认或产品的灭菌程序确认阶段进行。在随后的定期验证中，也要与物理验证一同进行。 
    验证时，腔室内的物品应按实际生产时的要求进行装载，生物指示剂的使用数量应足以反映整个物品内、外部的灭菌状况，生物指示剂既要遍布整个腔室，又要尽可能地放在热效应最差的部位，如物品中央、管路拐角以及腔室的排水口（干热灭菌的排风口）等。应尽可能地将生物指示剂与物理测定用温度探头放于同一位置，以准确获取物理参数与微生物致死性之间的相关性资料，这对偏差分析至关重要。放置在每个位置的生物指示剂均应做好标记，并且要与验证文件中生物指示剂的验证分布图相对应。 
   验证时，采用相关产品的最低灭菌条件进行灭菌处理。灭菌程序结束后，将生物指示剂取出并清点数量并确认无误后，送至微生物室，在适当条件下培养检查。培养检查时，需要考虑阳性对照 以及培养基的灵敏度等关键事项。 
   在初始验证阶段，分别用生物指示剂在相同的灭菌条件下至少连续运行3次，以评价灭菌工艺条件的稳定性；在以后的定期再试验中，每次检测一批即可。 
   验证时的生物指示剂分布、腔室内的产品装载及指示剂的控制要求均与过热灭菌工艺验证时生物指示剂的使用原则相同。 
生物指示剂验证的结果评价：在上述验证条件下，只有连续3次试验的所有结果均合格（均呈阴性）方可证明相应灭菌工艺的可靠性。