5　样品的制备
5.1　以无菌操作用灭菌刀、剪将样品剪碎。称取50 g放于无菌均质杯中。
5.2　加450 mL无菌磷酸盐缓冲稀释液于均质杯中以18000～20000 r/min均质2min。制成1 : 10样品稀释液。
5.3　取1: 10稀释液10.0 mL加到含有90.0 mL无菌磷酸盐缓冲液的稀释瓶中,充分混匀制成1 : 100的稀释液。
5.4　每个稀释度换用1支10.0mL灭菌吸管,按上述操作程序进行10倍递增稀释直至10**-6。6　检验步骤
6.1　平板计数法
6.1.1　取各稀释液0.1mL接种到MYP琼脂平板上。用灭菌L形玻璃棒均匀涂布于整个琼脂表面。每稀释度接种两个MYP琼脂平板。
6.1.2　将平板置于30℃培养24 h。
6.1.3　选取具有15～150个典型或可疑蜡样芽孢杆菌菌落的平板,进行计数。并计算同一稀释度两个平板的平均菌落数。　　
   蜡样芽孢杆菌在MYP琼脂平板上生成的菌落为微粉红色,环绕产生卵磷脂酶沉淀环。如反应不典型,可继续培养24h再计数。
6.1.4　计数后,从每个平板至少选取5个已计数的菌落分别接种于营养琼脂斜面,于30℃培养24 h,按第6章进行证实试验。
6.1.5　根据证实试验确定为蜡样芽孢杆菌的菌落数,按比例计算出该皿内的蜡样芽孢杆菌菌落数,然后乘其稀释倍数再乘以10,即得每克样品所含蜡样芽孢杆菌数并作出报告。例:将检样10**-4稀释液0.1mL涂布于MYP琼脂平板上,生成的可疑菌落数为25个,取5个进行鉴定,证实为蜡样芽孢杆菌的是4个,则1 g样品中蜡样芽孢杆菌数为(25×4/5)×10**4×10＝2×10**6。
6.2　最近似值(MPN)法　　
适用于污染蜡样芽孢杆菌数不大于10**3个/g的食品。
6.2.1　选用三管法MPN系列。取10**-1、10**-2、10**-3三种稀释液,每种稀释液接种3管胰酪胨大豆多粘菌素肉汤,每管接种1mL。
6.2.2　置于30℃培养48±2 h。
6.2.3　从长菌的试管取培养物划线接种到MYP琼脂平板上。
6.2.4　置30℃培养24～48 h。
6.2.5　从MYP琼脂平板上挑取粉红色绕有沉淀环的单个菌落,接种营养琼脂斜面,置30℃培养24 h,供作证实试验。
6.2.6　根据证实试验确定为蜡样芽孢杆菌的管数,由MPN表 [附录C(补充件)]计算蜡样芽孢杆菌的MPN值/g,并作出报告。