研究病毒的遗传变异，作为研究对象的病毒毒株，当然必须纯化。如果原始毒种本来就较混杂，或者已有许多变异病毒存在其中，那就容易产生假象，难以发现规律性的东西。其次，要有客观的鉴定指标和方法，以便正确地判定病毒特性的改变情况。
1.病毒的纯化 通常所谓的“纯系”病毒，亦即克隆株(clone)，其实也是一个或几个病毒粒子的许多子代的群体，而在这些群体中可能又出现了新的变异，尤其是RNA病毒。但因原种数量占绝对优势，在表现性状上仍可承认其为纯系。 动物病毒的纯系分离，亦即纯化，主要应用4种方法。 (1)蚀斑分离法：原理与分离噬菌体时应用细菌培养物的蚀斑法相同。即用高度稀释的病毒液感染玻璃瓶或平皿中培养的单层细胞，由于病毒呈现致细胞病变作用，而在单层细胞上形成蚀斑。从理论上讲，一个病毒粒子形成一个蚀斑，因此，根据蚀斑的大小、形状和色泽等性状，选择不同的代表进行移植传代，就有可能获得若干不同的纯系毒株(包括变异株)。但在实际上，一个蚀斑往往由几十个乃至几百个病毒粒子形成。因此，由一个蚀斑分离获得的毒株常是许多个病毒的后代，需要进行反复多次的蚀斑分离，才有可能获得来源自一个病毒粒子的“纯系”病毒。 (2)病斑分离法：某些可在鸡胚绒毛尿囊膜上增殖的病毒，例如痘病毒和某些疱疹病毒等，可以根据其在绒毛尿囊膜上形成的病斑特征进行纯系分离，其基本原理和方法同蚀斑分离法。 (3)终点稀释法：本法是在研究甲型流感病毒所谓的O－D变异时最早创立的。应用鸡胚羊膜囊分离甲型流感病毒时，第一代羊水病毒对豚鼠红细胞呈现很高的凝集价，但对鸡红细胞的凝集价很低，称为“O”相。取此第一代病毒在低倍稀释后作第二代羊膜腔传代，第二代病毒对豚鼠和鸡红细胞具有几乎相等的凝集价，称为“D”相。但如将第一代病毒作高倍稀释后再行接种传代，例如相当于1/2 ID50的稀释度——终点稀释度(在8个鸡胚中只有2～3个感染)，则第二代病毒仍能保持“O”相。如果随后继续应用这种“终点”稀释度传代，一般可以无限地保持病毒“O”相的性状。这是由于终点稀释时只有占多数的“O”相病毒粒子能够获得感染下一代鸡胚的机会，毒株性状因而保持不变。 终点稀释法目前已经广泛用于毒株纯化和变异株选育等工作，特别是在那些不能进行蚀斑分离或病斑分离的病毒。 假如在某原株病毒“A”中出现了少数变异型病毒“B”。为了纯化原株“A”，可将原毒高倍稀释，例如10-5～10-8，每个稀释度接种3～5管细胞培养物。根据细胞
病变出现情况，选定“终点”管。如在10-8稀释度接种的5个管中有3管出现细胞病变，则这3管就是终点。可以有条件地认为它们是一个或少数几个病毒粒子的后代。鉴定并选出其中最具“A”病毒特性的一株，并视需要将其再作2～3轮终点稀释，通常即可获得纯系的“A”毒株。 如欲分离获得纯系的变异型病毒“B”，应将原毒进行低倍稀释，例如10-1～10-3，多次传代，使变异株病毒的数量相对增多(在变异株病毒具有较高增殖能力和增殖速度的情况下，成功率将显著增加)，随后再作终点稀释分离方法。为提高分离率，可以应用终点或接近终点的多管细胞培养物，从中选取较多呈现变异型“B”株特性的管，再作以后几轮的终点稀释分离，直至获得纯系的“B”毒株。 (4)细胞克隆法：先在玻璃器皿内培养对病毒敏感的细胞，待其长成单层后，接种高度稀释的原始毒种。短时间(30～60分钟)温育后，应用细胞分散剂，例如胰酶、二乙胺四乙酸二钠(EDTA)或链霉蛋白酶(pronase)将单层细胞从玻璃表面剥离下来，并消化成单个细胞。将此细胞悬液用营养液高度稀释，使每毫升营养液内约含1个细胞。随后接种大量的小培养瓶或小培养管，每瓶(管)1毫升。这样，每个培养瓶或培养管内含有1个感染细胞。再置37℃温度下培养，约经2～3天，选择确含1个细胞的培养瓶(管)，即为初步纯化的病毒。再经几次同样的接种和筛选，就可获得纯化的毒株。应用微量培养板进行细胞克隆，当然更为简单方便。
2.遗传指标 鉴定病毒遗传变异特性的常用指标包括：①病毒粒子的形态；②抗原构造及血清学性状；③蚀斑或病斑的大小和性状；④致细胞病变(CPE)的特征；⑤病原性，包括感染范围和毒力；⑥对理化学因素的抵抗力；⑦对干扰素的敏感性。 病毒的遗传变异特性，由其本身和子代病毒粒子表现出来。但是，表型相同的病毒，其基因型(或称遗传型)可能不同。以蚀斑大小这一特性为例，O毒株形成大型蚀斑，M毒株形成小型蚀斑，纯型的O(OO)和M(MM)毒株及其子代当然分别地只形成大型和小型蚀斑。但是O与M的杂交或重组型病毒(Om或oM)，虽然也只形成一个型的蚀斑为其表型，但其后代中将可能出现两个型的蚀斑，因为它在基因型上含有O和M两种基因。反过来，基因型相同的病毒，又可因外界条件等的抑制影响而不充分表现其特性。表型是基因型和环境条件相互作用的结果。故在病毒遗传变异的研究中，必须掌握正确的方法，并保证实验条件的严密性和恒定性，力求消除各种意外干扰，并可考虑采用病毒成分或核酸分子的杂交和交互复活等验证手段
文章详情
