一. 目的

    掌握芽孢杆菌属常见种的分离、鉴定方法和技术。将土壤样品中分离的芽孢杆菌属未 知种鉴定到属。

二．原理

    芽孢杆菌能产生芽孢， 在沸水中加热不会失去生理活性， 但是不能产生芽孢的细菌会失 去活性，因而得到芽孢菌属，经过进一步的分离及生理生化鉴定得到枯草芽孢杆菌。

三．材料和器皿

显微镜 培养皿 试管 三角瓶 烧杯 移液管 涂布棒 载玻片 接种环 接种针 试管架 灭菌锅 培养箱 培养基：牛肉膏蛋白胨培养基 半固定培养基 淀粉培养基 v.p.实验培养基 孔雀绿溶液 番红复染液 NaOH 溶液等

四．操作步骤

 菌种的分离和纯化

（1）土样的采集：取土壤表层 5-10cm 下的肥土 100g 左右，把采得的土壤放入纸袋带 回实验室分离。

（2）平板的制备：溶化三角瓶中的牛肉汤蛋白胨培养基，以每皿 20ml 左右倒 6 个平 板。

（3）稀释分离法：称取肥土 5g 放入含有 45ml 水的三角瓶中，摇动片刻，然后将此瓶 用小火加热至悬浊液沸腾， 维持 15min。 而后静止 5min， 吸取上层液 0.1ml 加入到含有 4.5ml 无菌水的试管中，制成 1:100 浓度的悬液，然后分别吸取 10-2 和 10-3 土壤悬浊液各 0.2ml 滴加到上述牛肉汤蛋白胨培养基平板上（每种稀释度 2 皿） ，用涂布棒均匀涂布，并将培养 基倒置于 37℃恒温培养 1-2 天。

（4）挑菌及纯化：从上述分离的平板上分别挑取 2 个单菌落中部分菌体，在牛肉膏蛋 白胨培养基上划线纯化，经菌落特征的观察和镜检，确定是芽孢杆菌属纯种后，从中选择一 株转接于牛肉膏蛋白胨斜面上，置 37℃培养 1-2 天后备用。 （菌体应呈杆状，具芽孢，宽度 一致；菌落颜色、形状、质地、透明度等均一致）