目的

1．学习并掌握噬菌体效价的含义及其测定原理。

2．学习并掌握双层琼脂平板法测定噬菌体效价。

原理

噬菌体属于细菌病毒，它不具备完整的细胞结构，只能通过寄主细胞完成自我复制。因此人类只有通过电子显微镜才可观察到它们的形态结构。但是，由于噬菌体侵染细菌细胞后，可导致寄主细胞溶解死亡，并在琼脂培养基表面形成空斑-噬菌斑（Plaque），所以人们可以此来判断噬菌体的存在。

噬菌体的效价即：每毫升培养液中含有具感染性噬菌体的数量。它的测定常用双层琼脂平板法。由此法得到的噬菌斑形态、大小较一致，且清晰度高，计算准确。该方法首先在无菌培养皿内倒入营养琼脂作为底层，然后将适当稀释的噬菌体与培养至对数期的受体菌混合，保温吸附后，加入冷却至45℃左右的半固体琼脂糖，迅速混匀后铺平板，作为上层, 最后倒置培养。只要噬菌体具有感染力就可形成噬菌斑。根据不同稀释度平板上出现的噬菌斑数目，即可算出原液噬菌体的效价。

公式为： 噬菌斑形成单位（pfu/ml）= 噬菌斑数×稀释倍数×10

本实验选择的λ 噬菌体EA94， 是一被改造的烈性噬菌体。

材料

1．菌种：大肠杆菌（Escherichia coli）LE392

2．噬菌体：λ 噬菌体EA94

3．培养基：300 ml 三角瓶中分装100ml LB 培养基，300 ml 三角瓶中分装150 ml LB 固体培养基，15×150mm 试管分装3.5 ml 0.7%琼脂糖。

4．灭菌物品：20%麦芽糖，1mol/L MgSO4，10 mmol/L MgSO4，18×180mm 试管分装9 ml和20 ml 噬菌体缓冲液（20 mmol/L Tris pH 7.4，100 mmol/L NaCl，10 mmol/L MgSO4），100ml 离心管，100μl 枪头，微离心管，培养皿。

5．仪器：取样器，恒温水浴锅，恒温培养箱，台式离心机。

方法

1．制底层平板：将融化并冷却至45℃左右的LB 培养基倒入无菌培养皿，每皿约10-12 ml，共9 皿， 水平放置，凝固后，作好稀释度标记备用；

2．制备噬菌体稀释液：取20μL 噬菌体原液于19.98 ml 缓冲液中得到1000 倍（10－3）稀释液。再取1 ml 10－3 稀释液于9 ml 缓冲液中得到10－4 稀释液，依次类推直至10－7 稀释液，并在试管上作好相应标记备用；

3．制备受体菌细胞：将活化的大肠杆菌接种于50ml 牛肉膏蛋白胨培养液（内含0.5ml 20%麦芽糖和0.5ml 1mol/L MgSO4）中，经过夜培养后，离心收集菌体细胞，然后悬浮于20 ml 10mmol/L MgSO4.7H2O 中，备用；

4．吸附：用取样器分别取100μl 10－5、10－6、10－7 噬菌体稀释液和100μl 受体菌细胞液，充分混和后置于37℃恒温箱中保温25 分钟，并在微离心管上作好相应标记；

5．制上层平板：用取样器分别取出全部混合液加入到冷却至45℃左右的0.7%琼脂糖中，迅速混匀后，倒在有相应标记的底层平板上，边倒边在台面上摇匀，使上层培养基迅速铺满整个平皿；

6．培养：37℃倒置培养15-18 小时后，检查结果。

结果

记录平板上出现的噬菌斑数，并计算噬菌体原液的效价。