细胞壁是位于细胞最外层的一层坚韧而略具弹性的结构。它约占细胞干重的10%—25%。通过特殊染色方法或质壁分离法可在光学显微镜下看到细胞壁的存在。它具有固定菌体外形和保护菌体的作用。对有鞭毛的细菌来说，它又是鞭毛运动的必需条件。 
   细菌细胞壁的主要化学成分是肽聚糖。肽聚糖是由N—乙酰葡糖胺、N—乙酰胞壁酸以及短肽聚合而成的多层网状结构大分子化合物，其中的短肽一般由4个氨基酸组成，而且常有D一氨基酸和二氨基庚二酸存在。
   不同种类细菌细胞壁中肽聚糖的结构与组成不完全相同，一般是由N—乙酰葡糖胺与 N—乙酰胞壁酸重复交替连接构成骨架。短肽接在胞壁酸上，相邻的短肽又交叉相连，形成网状结构。相邻的短肽连接方式随细菌种类不同而有差别，如在大肠杆菌中是由相邻的短肽直接相连；在金黄色葡萄球菌中则是通过甘氨酸组成的五肽与相邻的短肽相连。 
   各种细菌的细胞壁厚度不等，化学成分不完全相同。革兰氏阳性细菌的细胞壁较厚，约20—80nm，肽聚糖含量高，约占壁重的40%—90%；另外还含有磷壁酸质。革兰氏阴性细菌的细胞壁较薄，约10nm。壁虽薄，但结构与化学组成却比革兰氏阳性细菌复杂得多。在电子显微镜下可见紧靠细胞质膜外有2—3nm厚的肽聚糖层，最外面还有一较厚（7—9nm）的外壁层。肽聚糖含量低，占5%—10%，所以肽聚糖层薄。外壁层主要由脂蛋白、脂多糖组成。类脂的含量大大高于革兰氏阳性细菌，但不含磷壁酸质。
   革兰氏染色法可以将细菌分成两大类：革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌。革兰氏染色方法是丹麦的医生革兰氏（C.Gram）在1884年首创。现在它是细菌学中一种重要的常用的染色方法。它的程序如下：先用草酸铵结晶紫液染色，再加碘液，使细菌着色，继而用乙醇脱色，最后用蕃红（沙黄）复染。如果用乙醇脱色后，仍保持其初染的紫色，称为革兰氏染色反应阳性；如果用乙醇处理后迅速脱去原来的颜色，而染上蕃红的颜色，称为革兰氏染色反应阴性。 
    关于革兰氏染色的原理，目前一般认为与细菌细胞壁的化学组成、结构和渗透性等有关，主要是物理作用。染色时，染料一碘复合物在细菌细胞内形成。当用95%乙醇作脱色处理时，一方面能把细胞壁中的脂质抽提出来，另一方面又使细胞壁引起脱水作用，使肽聚糖的孔径变小。由于革兰氏阴性菌的细胞含脂质较多，被乙醇抽提出去后，细胞壁各层结构变得松弛，又因其肽聚糖含量较少，虽孔径也因脱水作用而缩小，但仍有足够大小的通道和较大的通透性，这样可使染料一碘复合物被抽提出来，形成革兰氏阴性反应。反之，革兰氏阳性细菌的细胞壁含脂质较少，肽聚糖含量高，结构紧密，经乙醇脱水后，细胞壁孔径大为缩小，通透性明显降低，染料一碘复合物不易被抽提出来，形成革兰氏阳性反应。 
    青霉素的作用主要是阻碍细菌细胞壁中肽聚糖的合成，所以革兰氏阳性细菌对青霉素尤为敏感。