一、简介

  在微生物研究中，划线分离是常见操作，其目的在于将单一的微生物菌株从混合群体中分离出来，或者将细菌在琼脂平板表面充分地分散开，使单个细菌能固定在一点上繁殖，形成单个菌落，以达到分离纯化的目的。

  划线分离具体又有很多方式：三区划线法、四区划线法、十六线法、“之”字划线法等。其中“三区划线法”是实验室最常用的平板划线接种方法。具体操作如下：将平板分为3个区域，并分别标记为1、2、3区。首先在1区进行划线操作，起始位置可反复划线，然后“之”字形划线，划线区域不超过平板1/3；然后平板旋转60度，从1区的划线末端引出1-2条线继续在2区之字形划线，之后连续划线不再与1区接触，以此类推，进行3区的划线（如图1-a），总体来说，1区和2区总共约占整个平板面积的一半，另一半全部作为第3区域，一定要注意，务必保证当前操作的划线只能与相邻前一区域相交，绝不能与其他区域的划线有重叠。通过这种方法，能大大提高在2区或3区得到单一微生物菌株的概率。或者从1区往2区引线时，只引一条线，使这条线尽量与1区的所有线都有接触（如图1-b）

            图1  三区划线的两种引线方式

二、异常情况

  理论上看起来很简单，但在实际操作中，经常会遇到各种问题。最终导致的结果就是划不出单菌落或者单菌落很少。为什么划不出单菌落？常见原因如下：

  1、菌落生长过密

  造成菌落生长过密的原因主要有以下几个方面：没有充分利于好划线区域（如图2-a）；各区域线过于密集，线与线之间重叠（如图2-b）；与前一区交叉过多（如图2-a，2-c）；或者划线时接种环接触点变动，未始终保持接种环的一点接触琼脂表面，造成3区沾附的菌太多。

图2  菌落生长太密，划不出单菌落的情形

  为避免菌落过密造成划不出单菌落的问题，可以采取以下几种方法：待接种的细菌菌量过多时，第1区划线后务必灼烧接种环，再进行2区划线，2区与3区之间是否需要烧环，根据试验经验而定。通常来说，如果使用菌液进行划线，2区和3区是不需要烧环的，但如果使用菌苔划线，因为接种环上沾附的菌体很多，只要不是太难生长的菌，划线时必须烧环，否则很容易长得太密，分离不出单菌落（如图3）。

图3  挑取菌苔划线平板时，烧环不彻底划出的平板

  2、菌落生长过少

  造成菌落生长太少，无法长出足够多单菌落的原因主要有以下三点：

  （1）本身菌种生长比较差，不容易培养。

  （2）本来蘸取的菌液比较少，又多次烧环造成单菌落很少，这种情况通常出现在使用菌液进行划线，每个区都烧环时。

  （3）在平板划线过程中，烧过的接种环未充分凉透，接种环过热会导致细菌死亡，即虽然接种环沾到了菌体，但是多数都烫死了，从而无法在平板上生长繁殖。因此在划线过程中，需要控制接种环的温度，避免过热。

  （4）未掌握好划线力度与角度，划破琼脂，接种环上沾附的菌体大部分沾附到了划破的琼脂中，在后面的划线过程中，环上沾附的菌体很少，甚至接种环与培养基接触的部位根本不再有菌，自然划不出单菌落（如图4）。

图4  因划破琼脂平板造成单菌落太少的情况

三、好的划线效果展示

  比较理想的三区划线平板上，菌体生长的状态应该是：第1区和第2区前部的细菌生长成“直线”，第2区后部的细菌生长呈“虚线”，第三区呈“虚线”和离散的“小点”（即单菌落）。

  本文特挑选几个划线效果较好的平板进行展示（如图5），提供参考。

图5 分离效果较好的划线平板

四、注意事项

  采用分区划线法进行微生物的接种，为了达到较好的分离效果，要格外注意以下几点：

  1. 接种环的灭菌：在进行平板划线前，需要将接种环在火焰上灼烧至烧红，待其冷却后再进行接种操作。不烧环，通常会造成菌量太多，太密，长不成单菌落，如果接种环灼烧后未冷却就进行划线，可能会因为温度过高杀死菌种，造成下一区接种的菌量太少而无单菌落生长。

  2. 划线技巧：划线时要注意角度，保持接种环的一个面始终与平板接触，中间不能换面；要保证划线不间断，但又不与划过的路线重复或重叠。

  3. 防止污染：在进行划线操作时，要注意避免外界污染。例如，在打开试管塞、接种环挑取菌液等操作时，要在火焰旁进行。

  更加直观的划线手法，可参考视频：菌株的分离和纯化。

  总之，平板划线法虽然非常简单，但仍有很多细节需要注意，主要考虑使用的菌种是常规菌还是不易成活的菌，是使用的菌苔还是菌液，具体操作还包括接种环的灭菌、划线技巧、防止污染、操作规范等方面。在理论基础上进行反复练习，三分学七分练才是正道，一定不要十分学，一点都不练，这样即使学得再好，也划不出漂亮的三区。如果没有理论指导和规范的样板，盲目练习，一样得不出满意的结果。只要在理论指导下反复练习，每个人都能成为划线高手。

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