引言

  微生物监测是评估近岸河流水环境质量的重要环节，污水中常含有一定数量的病原微生物，是引发水传播疾病的重要来源。其中较为常见且具有重要影响的包括：沙门氏菌属、志贺氏菌属、肠道病原性大肠埃希氏菌以及肠道病毒等。沙门氏菌是由人、畜患者或带菌者随粪便排出的致病菌。本文以《水和废水监测分析方法（第四版）》为参考依据，选取具有代表性的沙门氏菌属，系统阐述其测定方法与流程，旨在为实际监测工作提供参考。

  对于样品采集及采样点位设置的相关内容可参考《近岸河流水域微生物取样方法及注意事项》及《近岸河流水域微生物采样点位的布置方法及注意事项》。

一、测定流程图

  水中沙门氏菌测定流程见下图。

二、水样的浓缩

1.浓缩的原因

  由于污水中病原微生物的浓度往往较低，因此在检验时需对水样进行大规模浓缩，再开展培养、平板分离、生化试验及血清学检查等操作。鉴于沙门氏菌在水中的存在形式具有较大变异性（目前已知沙门氏菌属有1700种以上血清型），且分离技术在灵敏度和选择性方面存在局限性，因此任何检测方法得到的阴性结果，均不能表明水中完全不存在沙门氏菌属菌种，也不代表其他病原微生物不存在。

2.水样浓缩

  水样采集量需依据水中沙门氏菌的浓度确定：通常饮用水为5000mL，饮用水源水为1000mL，污水为1mL~100mL。若水样量在100mL以下，可直接进行检验，无需浓缩；若超过100mL，则需采用滤膜法浓缩。

当水样浊度较低时，可通过孔径0.45μm、盘面直径142mm的无菌滤膜过滤收集微生物；若水样较为混浊，需先在滤膜表面敷盖硅藻土，具体操作如下：制备1L浓度为5g/L的硅藻土悬浮液（以蒸馏水配制），过滤500mL后，在悬浮液过滤接近完成时，迅速将水样注入剩余悬浮液中继续过滤，过滤结束后取出滤膜。

三、沙门氏菌的定性检验

1.前增菌

  将滤膜无菌条件下转移至含有100mL缓冲蛋白胨水的容器中。若样品量为10mL~100mL，需加入等体积的双倍浓度缓冲蛋白胨水；若样品量为1mL~10mL，则加入10倍体积的普通浓度缓冲蛋白胨水，于37℃培养16h~20h。

2.增菌

  将前增菌样品按1:10的比例转接至增菌液中（即10mL前增菌样品加入100mL增菌液）。需注意：当非沙门氏菌的密度较高时，建议按1:100的比例转接。

  接种后的增菌液培养条件如下：

  四硫磺酸盐培养液（TTB）：43℃培养22h和44h；

  氯化镁-孔雀绿培养液（RVS）：37℃培养22h；

  双倍浓度亚硒酸盐SF培养液：37℃培养24h。

  注意：若水样中沙门氏菌密度较低或菌体在环境中受到损伤（如经消毒剂处理），建议采用前增菌-四硫磺酸盐增菌液组合；若沙门氏菌密度较高，可使用氯化镁-孔雀绿增菌液；若需检验水中伤寒沙门氏菌，则应采用前增菌-双倍浓度亚硒酸盐F增菌液组合。

3.选择性培养基

  增菌培养后，将培养物接种至酚红煌绿琼脂和亚硫酸铋琼脂培养基表面。酚红煌绿平板于37℃培养24h，亚硫酸铋平板于37℃培养24h和48h，随后观察典型沙门氏菌落的存在情况。其中，酚红煌绿平板上的沙门氏菌菌落呈粉红色，亚硫酸铋平板上的菌落为灰黑色并带有金属光泽，菌落下方的培养基呈黑色。

沙门氏菌在酚红煌绿平板和亚硫酸铋平板上的生长特征

4.纯化及生化反应

  从每种选择性平板的每个平皿中选择2~3个典型或可疑菌落接种至营养琼脂37℃下培养22h进行纯化。使用纯化后的菌落进行证实试验。

  ① 三糖铁试验：使用接种针在培养基表面划线，然后进行底部穿刺。37℃下培养18h~22h，培养基的变化解释如下：

  典型反应（在斜面/底层中K，A和N分别代表碱性，酸性和中性反应；G代表产气，H₂S 1+至4+代表由于H₂S引起的变黑程度）。

  沙门氏菌：斜面呈碱性（K）/底层呈酸性（A）并产气（G），硫化氢生成量为1+至4+；

  伤寒沙门氏菌：斜面呈碱性（K）/底层呈酸性（A），硫化氢生成量微弱至1+。

  ② 脲酶试验：在琼脂斜面表面划线，37℃培养1d~2d。若反应呈红色，表明脲酶阳性；若呈黄色，表明脲酶阴性。沙门氏菌为脲酶试验阴性。

  ③ 苯丙氨酸脱氨试验：在琼脂斜面表面重新接种，37℃培养18h~24h后，向生长的斜面上滴加4~5滴10%氯化镁溶液。若琼脂表面和液体呈墨绿色，为阳性反应；若呈黄色或棕色，为阴性反应。沙门氏菌为苯丙氨酸脱氨阴性。

  ④ 吲哚试验：将可疑菌落接种到含5 mL培养液的试管内，37℃培养24h，加入1mL 吲哚试剂，若形成红色圆环，为阳性反应；若形成黄褐色圆环，为阴性反应。沙门氏菌为阴性反应。

  ⑤ 赖氨酸脱羧试验：接种于液体培养基表面以下，37℃培养24h。细菌生长后若呈紫色，表示阳性反应；若呈黄色，表明阴性反应。沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阳性。

  ⑥ β-半乳糖苷酶试验：在含有0.25mL生理盐水的小试管中，挑取可疑菌落制成菌悬液，滴加一滴甲苯，摇匀后置于37℃水浴中数分钟，再加入0.25mL的β-半乳糖苷酶试剂并混合，再将试管置于37℃水浴中24h。若呈黄色，表明阳性反应。大多数沙门氏菌为阴性，通常可在20min后观察结果。

5.血清学证实试验

  使用三糖铁琼脂斜面上的纯菌落。去除自身凝集菌株，用多价抗O血清、多价抗H血清和抗Vi血清进行测定。如有凝聚作用，反应为阳性。

6.证实试验的结果分析

  ① 具有典型生化反应或血清学反应的菌株为沙门氏细菌。

  ② 具有典型生化反应，而多价抗O血清、多价抗H血清或抗Vi血清不为阳性的菌株；或不具有典型生化反应，而具有典型血清学反应的菌株；或具有典型生化反应的自身凝集的菌株可能是沙门氏菌。

  ③ 不具有典型生化反应和血清学反应的菌株为非沙门氏细菌。

  ④ 被认为是沙门氏菌的菌株或可疑的菌株，应进一步检验其类型。

  *伤寒沙门氏菌不产气，不形成H₂S。

  **沙门氏菌Ⅲ亚属（亚利桑那菌）乳糖和β-半乳糖苷酶试验为阳性，Ⅱ亚属乳糖为阴性而β-半乳糖苷酶试验为阳性。

7.报告结果

  根据实验结果，报告一定体积的检验水样中存在或不存在沙门氏细菌。

四、沙门氏菌的定量检验

  水样中沙门氏菌的密度也可用MPN法进行估计。样品量为：

  使用的培养基和操作步骤同定性检验。根据出现的阳性管和阴性管数，查MPN表，然后计算每升水样中的沙门氏菌数。

五、相关培养基的采购

  青岛高科技工业园海博生物技术有限公司有适用于水中沙门氏菌检验的相关培养基，客户可根据实际情况和用途进行选用。

注:本文属海博生物原创,未经允许不得转载。