西瓜细菌果斑病是由西瓜细菌性果斑病菌（Acidovorax avenaesubsp.citrulli，简称A.a.c）西瓜亚种引起的、发生在西瓜的病害，也称细菌斑点病、西瓜水浸病、果实腐斑病等。该菌是革兰氏阴性菌，属原核生物界（Procaryotae）、薄壁菌门（Gracilicutes）、暗细菌纲（Scotobacteria）、假单抱菌科（Pseudomonadaceae）、嗜酸菌属（Acidovorax）。该菌不产生色素及荧光，菌体杆状，极生单根鞭毛。好气性。不产生硝酸还原酶和精氨酸双水解酶，无烟叶过敏反应。可在4℃-41℃范围内生长，明胶液化力弱，氧化酶和2-酮葡萄糖酸试验阳性。

  西瓜细菌果斑病在西瓜的苗期和成株均可发病，该病多始于成瓜向阳面，与地面接触处未见发病，瓜蔓不萎蔫，病瓜周围病叶上现褐色小斑，病斑通常在叶脉边缘，有时被一个黄色组织带包围。西瓜细菌性果斑病是西瓜的毁灭性病害，多雨、高湿、大水漫灌时易发生，主要分布在中国南方。该病主要会导致西瓜的果实表面产生病斑甚至腐烂，降低其商品价值和食用价值。

  西瓜细菌性果斑病的防治方法主要有加强检疫，不用病区的种子，选用优良盼早熟品种，加强栽培管理等。发病重的田块或地区，在进入雨季时，可以选用化学药剂进行防治。参照标准SN/T 1465-2004《西瓜细菌性果斑病菌检疫鉴定方法》对该病菌的形态特征、生物学特性、生化特性、寄主范围、传播途径，以及PCR特异性反应等检疫鉴定方法进行说明。

1. 种植观察

  将待测的瓜类种子种植于温室或实验室内的育苗钵（纸杯或塑料杯）中，每一育苗钵中种植2粒种子，每份种子样品种植5000粒左右，最低不少于3000粒种子，生长环境温度为25℃-35℃，相对湿度大于等于70%，种子出苗后15 d内观察幼苗发病情况。如果种植期间有发病幼苗，且表现出西瓜细菌性果斑病苗期的典型症状。在西、甜瓜苗期的主要症状为，子叶初生水浸状、近圆形暗绿色的凹陷病斑，后干枯呈褐色。真叶初为水浸状、浓绿色小点，以后逐渐扩大为多角形或不规则形的黄褐色病斑，湿度大时，在病斑背面分泌出白色粘液状菌脓，干燥后为白色菌胶质，病叶很少脱落。西（甜）瓜果实染病后，最初在果皮上出现很小的水浸状病斑，随后迅速扩展，病斑边缘不规则，呈暗绿色，病部果面凹陷，常开裂，向纵深发展，并不断横向扩展，引起果实腐烂。则采集可疑病株进行分离培养及常规检测，或直接用病叶提取核酸作PCR检测。

2. 分离培养

2.1种子中病原菌的分离培养

  分别称取待测瓜类种子样品各100g，分装于干净纸袋中，做好标记，供检测用。无菌操作下，将供试样品置于0.1%升汞溶液中表面消毒30s-80s（也可用含有效氯1%的次氯酸钠溶液表面消毒2min-4min），无菌水清洗三次，然后将种子移至无菌的小型电动粉碎机中，破碎种子，将处理好的种子装入一灭菌的广口瓶中，加入200mL灭菌的0.1mol/L磷酸钠缓冲液，混匀，25℃下过夜，次日用该溶液在事先制备好的金氏B平皿培养基上划线，每一样品做三个皿，28℃恒温培养48h。A.a.c在金氏B培养基上生长的菌落呈淡白色、光滑、不粘稠，无荧光。

2.2病叶中病原菌的分离培养

  用灭菌剪刀剪取病叶上的病斑，用含有效氯1%的次氯酸钠溶液中表面消毒50s-60s，无菌水清洗三次，然后将其移至灭菌培养皿中，加5滴-10滴无菌水，用灭菌镊子将病斑夹碎，使病组织液溶于无菌水中。用灭菌的移植环蘸取该液，在金氏B平皿培养基上划线，每一处理做三个皿，28℃恒温培养48h。

3. 氧化酶反应测定

  无菌操作下，在一个无菌培养皿中放一张灭菌滤纸，滤纸上加5滴现配的1%二甲基对苯二胺盐酸盐溶液，挑取生长24h的菌苔涂在滤纸上，若测试菌株的菌苔在20s内变成红色或紫色则为阳性反应，A.a.c标准菌株呈阳性反应；若菌苔颜色不变则为阴性反应。

4. 高温培养

  将供试菌株的菌落在金氏B平皿培养基上划线，每一处理做两个皿，40℃恒温培养48h，观察细菌生长情况。A.a.c标准菌株在40℃下可以生长，而该菌的几个近似种在40℃下不能生长。

5. 半选择性培养基培养

  将供试菌株分别在BFB-08、TWZ和EBB等半选择性培养基所制备的平皿培养基上划线，每一处理做三个皿，28℃恒温培养48 h。A.a.c标准菌株在BFB-08培养基上产生红褐色、凹陷、光滑的菌落，在TWZ培养基上产生深红色、光滑、球形凸起的菌落，在EBB培养基上产生淡蓝色、光滑菌落。

6. 致病性测定

  将待测菌株在金氏B培养基上培养48 h左右，配成10⁷CFU/mL-10⁸CFU/mL的细菌悬浮液，用喷雾法接种在预先培育的、具2片-3片真叶的健康西瓜或甜瓜幼苗上，每一菌株接种3株-5株，用无菌水做对照。接种后用塑料袋罩住植株，使植株在25℃-35℃、相对湿度大于等于70%的条件下生长，第三天开始观察发病情况，第十天结束，每天观察一次。A.a.c标准菌株可形成1.种植观察中所描述的症状。

7. PCR法检测

7.1病叶/病原细菌DNA的提取（此步也可省略。可直接用培养的菌株稀释成>10⁵CFU/mL的菌悬液作模板进行定性PCR检测。）

  病叶中总DNA的提取，将待检的新鲜病叶约0.2g用剪刀剪碎，置于一灭菌研钵中，加入适量液氮，迅速进行研磨，使叶片成粉状。然后将其转移至1.5mL离心管中，加入1.2mL DNA抽提缓冲液，充分混匀，65℃水浴中孵育30min。室温12000r/min离心10min，取上清液700μL移至1.5mL离心管中，加入5mL RNase A（10 mg/mL），37℃水浴中孵育30min。加入等体积的三氯甲烷-异戊醇（24 : 1），颠倒混匀。室温12000r/min离心10min，取上清液600μL移至1.5mL离心管中，加入等体积的CTAB沉淀液，混匀，室温12000r/min离心10min,弃上清液。加入600 μL氯化钠（1.2mol/L）溶解沉淀，室温静置5min，加入等体积的三氯甲烷-异戊醇（24 : 1），颠倒混匀。室温12000r/min离心10min，取上清液600μL移至1.5mL离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温静置30min。12000r/min离心10min，弃上清液。用70%冷乙醇洗涤沉淀两次，无水乙醇洗涤沉淀一次，晾干。加入50μL TE缓冲液溶解DNA沉淀。-20℃长期保存。

  病原细菌DNA的提取，将供试菌株在试管中的金氏B斜面培养基上培养48h（28℃）。在每一试管中加入0.1mol/L磷酸钠缓冲液10 mL洗下菌苔。将细菌悬浮液转移至15mL离心管中，12000r/min离心15min，弃上清液。在沉淀中加入TE缓冲液5mL、10%SDS溶液300mL，20mg/mL蛋白酶K 30μL，混匀， 37℃水浴孵育1h。加入等体积的三氯甲烷-异戊醇（24 : 1），混匀。10000r/min离心5min，将上清液移至一个新管中。加入等体积的酚-三氯甲烷-异戊醇（25 : 24 : 1），混匀，10000r/min离心5min，将上清液移至一个新管中。加入0.6体积的异丙醇，轻轻混合至DNA沉淀，10000r/min离心5min，弃上清液，用70%乙醇洗涤沉淀，晾干，加入50μL TE缓冲液溶解DNA沉淀，混匀，紫外分光光度计测其浓度，-20℃长期保存。

7.2定性PCR检测

  引物及探针的设计，通过DNAMAN软件对A.a.c菌株的16S rDNA序列与其它植物病原细菌的16S rDNA序列进行多重序列比较，找出A.a.c的特异性点突变区，应用引物和探针设计软件Primer Express设计实时荧光PCR引物和探针。

  扩增条件反应体系，10×PCR缓冲液12.5μL，25mmol/L MgCl23μL，10mmol/L dNTP 2μL，10 mmol/L引物各1μL，10mmol/L探针1μL，5U/L Taq DNA聚合酶0.2μL，模板DNA 2μL，加灭菌双蒸水至总体积为25μL。实时荧光PCR的反应条件参照按照试剂盒说明书。

  实时荧光PCR检测，将标准菌株、阳性菌株、检测菌株及其它阴性对照菌株体系放入实时荧光PCR仪反应板上，打开软件设置反应条件。运行程序，仪器自动实时监控PCR反应全过程并记录数据。反应结束后，打开分析软件，设置基线和阈值，仪器自动给出每个样品的Ct值，分析检测结果。

  结果判定，在常规生物学方法检测中，如果种植观察出现典型症状的病株、分离到的细菌菌株的氧化酶反应呈阳性、在40℃下可以生长、在选择性培养基上的菌落特征与描述相符、致病性测定表现典型症状，可以判定为检出西瓜细菌性果斑病菌。在分子生物学方法检测中，如果PCR法检测标准菌株，阳性菌株和被检测菌株有强的荧光增强信号，表现为阳性扩增，而其它有关病原细菌、空白对照都没有荧光信号增加，表现为阴性，说明所设计的探针对A.a.c有很强的特异性，可以把A.a.c与其它属种及亚种细菌菌株分开。同时也进一步验证了从种子/病叶中分离的被检测菌株为A.a.c。

8. 样品保存

  保存样品经登记和经手人签字后置于阴凉干燥、防虫防鼠处妥善保存3个月。对检出西瓜细菌性果斑病菌的样品应至少保存6个月，以备复检、谈判和仲裁，该类样品保存期满后，需经灭菌后方可处理。

9. 菌株保存

  从检测样品中分离到并鉴定为西瓜细菌性果斑病菌的菌株，应妥善保存。将菌株接种于金氏B培养基斜面上，28℃恒温培养48h。无菌操作下，在一灭菌培养皿中加入10mL无菌水，用灭菌的移植环挑取菌落5环，置于灭菌的菌种保存管中，对每一菌种保存管封口，写好标签，室温下避光保存；或用真空冷冻干燥机制成冻干粉，-20℃下保存。

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