在细胞生物学的日常工作中，细胞就是实验的“活材料”。无论是基础研究、药物筛选，还是疾病模型建立，保持细胞的稳定性和可重复性都是首要任务。因此有关贴壁细胞、悬浮细胞和常见肿瘤细胞的传代、冻存与复苏，如何判断与检测细菌、真菌与支原体污染，都对细胞培养至关重要。

一、常见细胞类型

  贴壁细胞，以附着生长为主；传代常在70%–90%汇合度时进行，常用比例为1:3–1:5（对增殖极快的系可更高）。

  悬浮细胞，不贴壁，传代通常通过直接稀释或离心换液，保持合适细胞密度比传代比例更重要。

二、细胞的生长与传代

  1、贴壁细胞（典型例：HeLa、Vero、293等）的生长方式为依附于培养器具表面，形成铺展单层。当细胞覆盖面积达到70%–90%即对数生长期时传代，以避免接触抑制影响细胞状态。常用传代比例为1:3–1:5，生长极快的细胞系可做到1:10（即1份旧细胞接入9份新培养基）。关键操作点如胰酶的消化时间须严格控制；消化后立即用含血清的培养基终止以保护细胞；轻柔吹打使细胞成单细胞悬液，离心（约200×g–300×g，3min–5min）后重悬并按比例接种。培养过程中如过度消化导致细胞圆形化后恢复困难；传代过晚（过度汇合）会改变生物学表型。

  2、悬浮细胞（典型例：某些淋巴瘤、髓系细胞系），生长方式为在培养液中自由漂浮，不依赖表面附着。传代方法为直接稀释法和离心换液法，直接稀释法即为取出或吸弃一部分旧培养液，再补加同体积新培养基；离心换液法是收集后离心（200×g–300×g，3min–5 min），弃上清，重悬并按所需稀释接种。传代比例通常为1:1–1:4，可依据细胞增殖速率调整。操作过程中需注意避免强剪切（如过猛吹打或高速离心），维持合适密度（过稀生长慢、过密导致坏死或代谢产物积累）。悬浮细胞培养时常会产生细胞团块或黏连，影响计数和传代，需要预处理如轻柔吹打、过滤或短暂低速离心，去除碎片。

  3、肿瘤细胞系往往生长迅速、代谢活跃，对培养条件和传代频率更敏感。对贴壁型肿瘤细胞可按贴壁细胞流程操作，对胰酶敏感的系可使用更温和的方法如低浓度胰酶处理等。频繁传代以维持细胞处于对数期，避免长期过稀或过密的培养。

三、冻存与复苏

  冻存应选择健康、无污染、处于对数生长期的细胞，一般在传代后48h为最佳冻存时机。冻存时注意细胞密度，贴壁细胞大约5×10⁶个/mL–1×10⁷个/mL；悬浮细胞大约3×10⁶个/mL–5×10⁶个/mL，可视细胞类型调整。在分装时，使用无菌冻存管，标注细胞名、细胞批次、冻存日期和操作者信息，便于追溯。细胞可使用程序降温盒或程序冷冻箱保存，控制降温速率约1°C/min，可先在-80°C过夜，再移入液氮罐长期保存。

  复苏时需快速解冻：将冻管从液氮取出后立即在37°C水浴中快速解冻（通常<1 min），避免慢速解冻形成致命冰晶。并尽快将解冻细胞稀释在大量预热培养基中，或转移离心去除上清（200×g–300×g，3min–5min），以减少保护剂对细胞的毒性。贴壁细胞复苏后避免立即频繁换液或移动培养瓶，让细胞有24 h左右时间稳固附着；悬浮细胞建议复苏后48h–72h内低离心或少操作以便稳定。

  在复苏初期需密切观察细胞附着/增殖情况，并在1周内评估细胞恢复质量（形态、增殖速率、污染情况）。

四、污染的表现与检测方法

1、细菌污染

  细菌污染的典型表现为培养液短时间内浑浊或变黄（pH降低）、气味改变；显微镜下可见运动颗粒（杆菌或球菌）；细胞停止增殖或大量脱落。在发现污染时视具体情况决定丢弃培养物或隔离鉴定并用抗生素处理，严重污染的细胞系应丢弃以免影响后续实验。实验室内应当定期清洁与严格无菌操作为预防主策略。

2、真菌/酵母污染

  当培养液中出现絮状物、肉眼可见絮状或粒状沉淀；显微镜可见丝状菌丝或孢子结构时，通常需立即处置并消毒，受污染的培养器具与试剂需报废或高压灭菌处理。

3、支原体（Mycoplasma）——最危险的“隐形敌人”

  支原体的体积小，无细胞壁，不易被常规显微镜或培养液浑浊发现；可与宿主细胞共存，造成代谢改变、染色体异常和实验数据偏差。当细胞出现增殖速率慢、实验重复性差、转染效率降低、染色/流式数据异常等现象时，可能存在支原体污染。

  检测方法可采用荧光染色（如Hoechst/DAPI），在荧光显微镜下可见细胞周围或核外的点状荧光（代表支原体DNA），简单直观但需要经验判断；或使用PCR检测，灵敏且特异，是常用的支原体筛查方法；也可用商业试剂盒，包括ELISA、培养法等。

  一旦确认存在支原体污染，建议丢弃受污染的细胞系（重建库或回退到未被污染的库存）。在资源受限情况下，部分实验室可尝试专用抗支原体药物处理，但这会影响细胞状态且非万无一失。

五、实践建议

  1、减少不必要的抗生素依赖，长期使用抗生素掩盖低水平污染，容易产生耐药菌并掩盖支原体感染。正确的做法是保持严格无菌操作并定期检测。

  2、独立保存不同细胞系，不同细胞系应分盒分层、清晰标记，避免交叉污染。

  3、建立“库存-工作”体系，长期保存的主库用以恢复并保留干净的原代细胞；日常实验使用工作库。

  4、定期检测支原体，建议每月或在收到新细胞/关键实验前做支原体PCR检测。

  5、记录完整，每次传代、冻存和复苏都应记录批次、传代次数、操作人和设备状态，便于追溯与质量控制。

六、结语

  细胞培养既是实验室的一项“手工活”，也是科学严谨性的基础工程。掌握传代与冻存的要领、细心观察细胞状态、并对污染保持高度警惕，能显著提升实验结果的可靠性与可重复性。

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