丁酸梭菌活菌制剂对肠道菌群影响的研究

2010-11-22 10:01:38 维普资讯

摘要　通过动物实验和人体试食试验，对丁酸梭菌活菌制剂一泰平片对肠道菌群的影响进行了研究。结果表明：受试对象肠道内的双歧杆菌的数量增加，差异有极显著性(p≤0.01)，乳杆菌的数量增加，差异有显著性(p≤0.05)。说明丁酸梭菌活菌制剂一泰平片具有一定的增殖肠道内有益菌和抑制有害菌的作用。
　　关键词：丁酸梭菌　肠道菌群
　　丁酸梭菌(Clostridium butyricum)是1933年由日本的宫入近治博士首先发现并报告的。其活菌制剂作为整肠剂在日本使用已有50年。我们对丁酸梭菌活菌制剂一泰平片对小鼠及人的肠道菌群的影响进行了实验研究。
　　1　材料与方法
　　1.1　样品　由深圳医药保健品进出口有限公司金华分公司提供的泰平片，经测定每片含丁酸梭菌活菌数为0.4×10⁵CFU／g。
　　1.2　实验动物　由中国药品生物制品检定所实验动物中心提供的健康成年雄性BALB／c小鼠40只(批准号：京动管制字1994经081号)，体重18g～22g。
　　1.3　受试人群　1个月内未患过胃肠疾病、未服用过抗生素类药物、未服用过微生态制剂；血液、尿、便常规检查及肝功能检查，心率、血压、心电图、B超(肝、胆、脾、肾)检查，指标全部正常的30名志愿者，年龄25岁～60岁，男女各半。
　　1.4　实验方法
　　1.4.1　样品中丁酸梭菌活菌计数　无菌称取25g样品，加入225ml无菌生理盐水中混匀，10倍稀释。选择合适的稀释度，接种于TPY培养基。37℃48h～78h，厌氧培养，计数丁酸梭菌。
　　1.4.2　肠道菌群检验方法　双歧杆菌：BBL培养基，37℃48h～72h厌氧培养；乳杆菌：LBs培养基，37℃48h培养；肠杆菌：EMB培养基，37℃24h培养；肠球菌：叠氮钠-结晶紫-七叶苷培养基，37℃24h培养；拟杆菌：Bd培养基，37℃48h厌氧培养；产气荚膜梭菌：TSC培养基，37℃24h厌氧培养；丁酸梭菌：TPY培养基，37℃48h厌氧培养。样品稀释液：自制。
　　1.4.3　动物试验　泰平片人体推荐量为每人每日3片，即每人0.9g／60kg·b.w,相当于0.015g/kg·b.w，小鼠等效剂量为人体推荐量的10倍，即每日0.15kg·b.w(中剂量)，上、下各设一个剂量组：0.45g／kg·b.w(高剂量)和0.075g/kg·b.w(低剂量)。选用40只雄性小鼠随机分成4组，每组10只，其中1组为正常对照组，对灭菌稀释液灌胃，灌胃量按0.2ml／10g·b.w计算，其余3组以泰平片混悬液灌胃，每日1次，连续7天，于给受试物最后一次24h后，无菌采取小鼠粪便0.1g～0.4g，置已称重的带玻璃珠的干燥灭菌小试管中，再称重，计算出小鼠粪便重量，并加灭菌稀释液，稀释10倍，振荡1分钟，再依次10倍系列稀释，选择合适的稀释度，分别接种在各选择性培养基上。
　　1.4.4　人体试食试验　实验采用自身对照。试食受试物前，收集受试者新鲜粪便于便盒中，立即送检。定量称取标本，10倍稀释并匀浆后，分别接种至各选择性培养基，检验肠道菌群。受试者每日服用泰平片3片(每片重0.3g，相当于每日服用丁酸梭菌1.2×10⁵CFU)，连续10d。于给受试物最后一次24h后，再收集受试者新鲜粪便，检验肠道菌群。
　　2　结　果
　　2.1　泰平片中丁酸梭菌活菌计数结果见表1。
表1　泰平片中丁酸梭菌活菌计数(接种量为0.1ml)

稀释度	平板1	平板2	平均数	结果 (CFU/g)
10^-3	14	10	12	1.2×10⁵
10^-4	1	2	1.5	1.5×10⁵

　　由表1可知，泰平片含丁酸梭菌活菌数为1.2×10⁵CFU/g。
　　2.2　泰平片对BALB／c小鼠体重的影响见表2。表2　试验前后各组小鼠的体重及增长值

组别	动物数　　(只)	试验前	试验后	增长值　　(g)
组别	动物数　　(只)	体重(g)	体重(g)	增长值　　(g)
阴性对照组	10	17.74±0.42	21.63±0.38	3.89±0.70
低剂量组	10	17.96±0.28	21.65±0.55	3.69±0.49
中剂量组	10	17.91±0.33	21.80±0.89	3.89±0.86
高剂量组	10	18.05±0.40	21.77±0.61	3.72±0.72

　　由表2可知，经统计学处理，小鼠的初始体重在低、中、高剂量组和对照组间比较，差异无显著性(p≥0.05)。经口给予小鼠不同剂量的受试物7天后，小鼠的体重增长值在低、中、高剂量组和对照组间比较，差异无显著性(p≥0.05)，即泰平片对小鼠的体重增长无影响。
　　2.3　泰平片对BALB／c小鼠肠道菌群调节的作用结果见表3。表3　泰平片对小鼠肠道菌群的影响(logcfu,x±SD,n=10)

细菌	正常对照组		低剂量组		中剂量组		高剂量组
细菌	灌服前	灌服后	灌服前	灌服后	灌服前	灌服后	灌服前	灌服后
肠杆菌	3.58±1.54	2.80±1.24	2.84±1.28	2.24±0.73	4.35±1.62	3.28±1.50	3.56±1.56	2.58±1.17
肠球菌	4.94±0.74	4.90±0.33	5.04±0.58	5.51±0.74	5.24±1.25	5.59±1.26	4.91±0.48	5.80±1.25^**
双歧杆菌	8.47±0.51	8.78±0.33	8.85±0.35	9.26±0.51^△	8.83±0.51	9.26±0.60^△	8.71±0.30	9.42±0.50^**△△
乳杆菌	7.39±1.04	8.25±0.65	6.87±0.79	8.55±0.73^**	7.70±1.18	8.93±0.34^**△△	7.60±1.06	8.90±0.44^**△

　　 *与灌服受试物前比较(自身对照)　p≤0.05　△与正常对照组(灌服稀释液后)比较p≤0.05
　　**与灌服受试物前比较(自身对照)　p≤0.01　△△与正常对照组(灌服稀释液后)比较p≤0.01　　由表3可知，正常对照组灌服样品稀释液前后，小鼠肠道菌群数量无明显变化，差异无显著性(p≥0.05)。经口给予小鼠受试物后，小鼠肠道内的肠杆菌、双歧杆菌、乳杆菌数量发生改变。低剂量组与灌服受试物前比较，乳杆菌的数量明显增加，差异有极显著性(p≤0.01)；中剂量组与灌服受试物前比较，乳杆菌的数量明显增加，差异有极显著性(p≤0.01)，高剂量组与灌服受试物前比较，双歧杆菌、乳杆菌、肠球菌的数量明显增加，差异有极显著性(p≤0.01)。
　　低剂量组与正常对照组比较，双歧杆菌的数量明显增加，差异有显著性(p≤0.05)；中剂量组与正常对照组比较，双歧杆菌的数量明显增加，差异有显著性(p≤0.05)，乳杆菌的数量明显增加，差异有极显著性(p≤0.01)；高剂量组与正常对照组比较，双歧杆菌的数量明显增加，差异有极显著性(p≤0.01)，乳杆菌的数量明显增加，差异有显著性(p≤0.01)。
　　2.4　泰平片对人体肠道菌群调节的作用结果见表4。
表4　泰平片对人体肠道菌群的影响(logcfu,x±SD，n=30)

	肠杆菌	肠球菌	拟杆菌	产气荚膜梭菌	双歧杆菌	乳杆菌	丁酸梭菌
服用前	6.75±1.13	5.35±1.13	8.25±1.64	1.94±1.19	8.21±0.96	6.97±0.98	＜3
服用后	7.00±0.92	5.56±1.78	9.78±0.58^**	1.96±1.25	9.75±0.47^**	8.45±0.68^**	4.97±0.38

　　 *服用受试物后与服用受试物前比较　p≤0.05，**服用受试物后与服用受试物前比较 p≤0.01　　由表4可知，受试人群服用泰平片，肠球菌、肠杆菌、产气荚膜梭菌的数量差异无显著性(p≥0.05)，双歧杆菌、乳杆菌、拟杆菌的数量明显增加，差异有极显著性(p≤0.01)。服用前，取粪便标本10^-2稀释液0.1mL接种于TPY培养基，均未检出丁酸梭菌，服用后，全部粪便标本均检出丁酸梭菌。说明受试人群肠道内菌群发生了有益的变化。
　　2.4　受试者自觉症状观察　服用泰平片后，部分受试者有排气增多的现象，部分受试者的排便状况有所改善，未见有不良反应。
　　3　讨　论
　　丁酸梭菌是革兰阳性厌氧芽孢菌，在人体肠道内是非常住菌，其芽孢对外界不利因素的抵抗力较强，由丁酸梭菌芽孢制成的微生态制剂耐贮存。日本对丁酸梭菌的生物学特性、生理功能做过大量的研究。将其作为微生态调节剂使用已有50年。泰平片是含有丁酸梭菌活菌的微生态制剂，给小鼠灌服后，肠道内双歧杆菌和乳杆菌的数量明显增加。同样在人体试食试验中，每日服用3片泰平片后，肠道菌群发生了有益的变化：粪便中的有益菌双歧杆菌和乳杆菌的数量明显增加，肠球菌、肠杆菌以及有害菌产气荚膜梭菌的数量无明显变化。