创伤弧菌检验标准操作程序

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创伤弧菌检验标准操作程序

2020-3-25 15:44:24 2020年国家食品污染和有害因素风险监测工作手册(下卷)-微生物方法SOP

1 方法来源

FDA/BAM Chapter 9 Vibrio2004

2 适用范围

本程序规定了食品中创伤弧菌（Vibrio vulnificus）的检验方法。本程序适用于食品中创伤弧菌的检验。

3 设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下。

3.1 恒温培养箱：36℃±1℃、39.5℃±0.5℃。

3.2 冰箱：2℃～5℃、7℃～10℃。

3.3 恒温水浴箱：36℃±1℃。

3.4 均质器或无菌乳钵。

3.5 天平：感量0.1 g。

3.6 无菌试管：18 mm×180mm、15mm×100mm。

3.7 无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。

3.8 无菌锥形瓶：容量250mL、500 mL、1000mL。

3.9 无菌培养皿：直径90mm。

3.10 无菌手术剪、镊子。

3.11 PCR仪。

3.12 电泳装置。

3.13 凝胶分析成像系统。

3.14 PCR超净工作台。

3.15 高速台式离心机（15000r/min）。

3.16 微量可调移液器（2μL、10μL、100μL、1000μL）和相应吸头。

4 培养基和试剂

4.1 3％氯化钠碱性蛋白胨水：见附录A中A.1。

4.2 改良纤维二糖-多粘菌素B-多粘菌素E（mCPC）琼脂：见附录A中A.2。

4.3 纤维二糖-多粘菌素E（CC）琼脂：见附录A中A.3。

4.4 3％氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂：见附录A中A.4。

4.5 3％氯化钠三糖铁琼脂：见附录A中A.5。

4.6 嗜盐性试验培养基：见附录A中A.6。

4.7 3％氯化钠赖氨酸脱羧酶试验培养基：见附录A中A.7。

4.8 3％氯化钠MR-VP培养基：见附录A中A.8。

4.9 3％氯化钠溶液：见附录A中A.9。

4.10 氧化酶试剂：见附录A中A.10。

4.11 革兰氏染色液：见附录A中A.11。

4.12 邻硝基酚-β-D-半乳糖苷（ONPG）试剂：见附录A中A.12。

4.13 Voges-Proskauer（V-P）试剂：见附录A中A.13。

4.14 生化鉴定试剂盒。

4.15 DNA提取液。

4.16 6×上样缓冲液。

4.17 0.5×TBE。

4.18 琼脂糖。

4.19 DNA分子量标记物（100 bp-1000 bp）。

4.20 PCR反应配套试剂。

第一法定性检验

5 检验程序

创伤弧菌检验程序见图1。

6 操作步骤

6.1 样品制备

6.1.1 非冷冻样品采集后应立即置7℃～10℃冰箱保存，尽可能及早检验；冷冻样品应在45 ℃以下不超过15min或在2 ℃～5 ℃不超过18 h解冻。

6.1.2 鱼类和头足类动物取表面组织、肠或鳃。贝类取全部内容物，包括贝肉和体液；甲壳类取整个动物，或者动物的中心部分，包括肠和鳃。如为带壳贝类或甲壳类，则应先在自来水中洗刷外壳并甩干表面水分，然后以无菌操作打开外壳，按上述要求取相应部分。

6.1.3 以无菌操作取样品25g（mL），加入3％氯化钠碱性蛋白胨水225mL，用旋转刀片式均质器以8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或拍击式均质器拍击1min～2min，制备成1:10的样品匀液。如无均质器，则将样品放入无菌乳钵，自225mL3％氯化钠碱性蛋白胨水中取少量稀释液加入无菌乳钵，样品磨碎后放入500mL无菌锥形瓶，再用少量稀释液冲洗乳钵中的残留样品1～2次，洗液放入锥形瓶，最后将剩余稀释液全部放入锥形瓶，充分振荡，制备1:10的样品匀液。

6.2 增菌

将上述1:10样品匀液于36℃±1℃培养18 h～24 h。

6.3 分离

6.3.1 对所有显示生长的增菌液，用接种环在距离液面以下1cm内沾取一环增菌液，于mCPC或CC平板上划线分离。于39℃～40 ℃过夜培养（如果达不到39 ℃～40 ℃，则35 ℃～37 ℃）。

6.3.2 典型的创伤弧菌在mCPC和CC平板上呈现为圆的、扁平的、中心不透明边缘透明的黄色菌落，直径1 mm～2 mm。

6.4 纯培养

挑取3个或以上可疑菌落，划线接种3％氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板，36℃±1℃培养18 h～24 h。

6.5 初步鉴定

6.5.1 氧化酶试验：挑选纯培养的单个菌落进行氧化酶试验，创伤弧菌为氧化酶阳性。

6.5.2 涂片镜检：将可疑菌落涂片，进行革兰氏染色，镜检观察形态。创伤弧菌为革兰氏阴性，呈棒状、弧状、卵圆状等多形态，无芽胞，有鞭毛。

6.5.3 挑取纯培养的单个可疑菌落，转种3%氯化钠三糖铁琼脂斜面并穿刺底层，36℃±1℃培养24 h观察结果。创伤弧菌在3%氯化钠三糖铁琼脂中的反应为底层变黄不变黑，无气泡，斜面颜色不变或红色加深，偶尔斜面变黄。

6.5.4 嗜盐性试验：挑取纯培养的单个可疑菌落，分别接种0%、6%、8%和10%不同氯化钠浓度的胰胨水，36℃±1 ℃培养24 h，观察液体混浊情况。创伤弧菌在无氯化钠、8％氯化钠和10%氯化钠的胰胨水中不生长或微弱生长，在6%氯化钠的胰胨水中生长旺盛。

6.6 确证鉴定

取纯培养物分别接种含3%氯化钠的赖氨酸脱羧酶试验培养基、MR-VP培养基，36℃±1℃培养24 h～48 h后观察结果；3%氯化钠三糖铁琼脂隔夜培养物进行ONPG试验。可选择生化鉴定试剂盒。创伤弧菌的生化性状见表1，创伤弧菌主要性状与其他弧菌的鉴别见表2。

表1 创伤弧菌的生化性状

试验项目	结果
革兰氏染色镜检	阴性，棒状或弧状
氧化酶	＋
动力	＋
D-纤维二糖	＋
蔗糖	－
葡萄糖	＋
分解葡萄糖产气	－
乳糖	＋
硫化氢	－
赖氨酸脱羧酶	＋
V-P	－
ONPG	＋
注：＋阳性；－阴性。

表2 创伤弧菌主要性状与其他弧菌的鉴别

名称

氧

化

酶

赖

氨

酸

精

氨

酸

鸟

氨

酸

明

胶

脲

酶

︱

℃

生

长

蔗

糖

︱

纤

维

二

糖

乳

糖

阿

拉

伯

糖

︱

甘

露

糖

︱

甘

露

醇

ONPG

嗜盐性试验

NaCl含量（％）

创伤弧菌
V. vulnificus

＋

－

＋

－

＋

－

＋

－

＋

－

＋

－

副溶血性弧菌

V. parahaemolyticus

＋

－

＋

－

＋

－

＋

－

＋

－

溶藻弧菌

V. alginolyticus

＋

－

＋

－

＋

－

＋

－

＋

霍乱弧菌

V.cholerae

＋

－

＋

－

＋

－

＋

－

拟态弧菌

V.mimicus

＋

－

＋

－

＋

－

＋

－

河弧菌

V. fluvialis

＋

－

＋

－

＋

－

＋

－

＋

－

＋

－

弗氏弧菌

V.furnissii

＋

－

＋

－

＋

－

＋

－

＋

－

＋

－

梅氏弧菌

V. metschnikovii

－

＋

－

＋

－

＋

－

＋

－

＋

－

霍利斯弧菌

V. hollisae

＋

－

＋

－

＋

－

嗜水气单胞菌

A.hydrophilia

＋

－

＋

－

＋

－

类志贺邻单胞菌
P. shigelloides

＋

－

＋

－

＋

－

注：nd 表示未试验；V 表示可变。

6.7 PCR鉴定（选做）

6.7.1 DNA模板的制备

取可疑的纯菌落加入500 μL灭菌dH2O中混匀煮沸10 min，15000×g离心3 min。取上清液储存在-20℃直至使用。也可以用商业化的DNA提取试剂盒并按其说明提取制备DNA模板。

6.7.2 PCR扩增

6.7.2.1 引物

Vvh-785F	5' ccg cgg tac agg ttg gcg ca 3'
Vvh-1303R	5' cgc cac cca ctt tcg ggc c 3'

扩增片段长度：519 bp

6.7.2.2 阴性对照、阳性对照设置

阴性对照(空白对照)以灭菌水作为PCR反应的模板；

阳性对照采用含有检测序列的DNA（或质粒）作为PCR反应的模板。

6.7.2.3 PCR反应体系

试剂	反应体积
dH2O	28.2 μL
10× Buffer. MgCl2	5.0 μL
dNTPs	8.0 μL
引物	7.5 μL
模板	1.0 μL
Taq酶	0.3 μL
总体积	50.0 μL

6.7.2.4 PCR反应程序

预变性	94℃	10 min；
变性	94℃	1 min，
退火	62℃	1 min，
延伸	72℃	1 min，25个循环；
终延伸	72℃	10 min；
保存	8℃	——

6.7.2.5 电泳

用0.5×TBE制备1.5％的琼脂糖凝胶（含EB或Goldview0.5μg /mL，）。各取5 μl PCR产物点样（可包括适量上样缓冲液），用DNA分子量标记物做参照，电压100 V，电泳50 min（根据实验室仪器情况确定具体电泳条件）。使用凝胶成像系统对电泳结果进行保存和分析。

6.8 结果判定

阴性对照未出现条带，阳性对照出现预期大小的扩增条带条件下，如待测样品未出现519 bp大小的扩增条带，则可判定该样品检验结果为阴性；如待测样品出现519 bp大小的扩增条带，则可判定该样品检验结果为阳性。

如果阴性对照出现条带和/或阳性对照未出现预期大小的扩增条带，本次待测样品的结果无效，应重新进行试验，并排除污染因素。

6.9 报告

根据生化或PCR结果，报告25 g（mL）样品中检出或未检出创伤弧菌。

第二法 MPN计数法

7 操作步骤

7.1 样品制备

同6.1。

7.2 增菌

7.2.1 用灭菌吸管吸取1:10样品匀液1 mL，注入含有9 mL 3％氯化钠碱性蛋白胨水的试管内，振摇试管混匀，制备1:100的样品匀液。

7.2.2 另取1 mL灭菌吸管，按6.2.2.1操作程序，依次制备10倍系列稀释样品匀液，每递增稀释一次，换用一支1 mL无菌吸管。

7.2.3 根据对检样污染情况的估计，选择3个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种3支含有9mL3％氯化钠碱性蛋白胨水的试管，每管接种1mL。置36℃±1℃恒温箱内，培养18 h～24 h。

7.3 分离鉴定

同定性检测。

8 结果与报告

根据证实为创伤弧菌阳性的试管管数，查最可能数（MPN）检索表，报告每g（mL）创伤弧菌的MPN值。