1   方法来源

    《食品及土壤中产肉毒毒素梭状芽孢杆菌检测实验室操作流程》和《婴儿食品、生物样品及环境中梭状芽孢杆菌检测实验室操作流程》

    GB 4789.12-2016食品安全国家标准食品微生物学检验肉毒梭菌及肉毒毒素检验

2   适用范围

    本程序规定了食品中梭状芽孢杆菌（Clostridium Prazmowski）的检验方法。本程序适用于食品中梭状芽孢杆菌（Clostridium Prazmowski）的定性检验，包括丁酸梭菌（Clostridiumbutyricum）、产气荚膜梭菌（Clostridiumperfringens）、艰难梭菌（Clostridiumdifficile）、生孢梭菌（Clostridiumsporogenes）、肉毒梭菌（Clostridiumbotulinum）、巴氏梭菌（Clostridiumbarati）等。

3   设备和材料

   除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

3.1  恒温培养箱（4～50℃±1℃）。

3.2  厌氧装置（厌氧罐、厌氧箱等）。

3.3  生物安全柜。

3.4  比浊仪。

3.5  冰箱（0～4℃、-20℃及-80℃）。

3.6  离心机（0～20000rpm）。

3.7  样品均质器。

3.8  涡旋器。

3.9  电泳仪。

3.10  PCR仪。

3.11  恒温振荡器。

3.12  电热恒温水浴箱（10℃～100℃）。

3.13  电子天平（精度0.01g及0.0001g）。

3.14  荧光PCR仪。

3.15  高压灭菌锅。

3.16  显微镜。

3.17  灭菌吸管。

3.18  PCR管。

3.19  无菌锥形瓶。

3.20  无菌培养皿：直径90mm。

3.21  无菌离心管。

3.22  无菌试管。

3.23  载玻片。

3.24  酒精灯。

3.25  pH计或pH比色管或精密pH试纸。

4   培养基和试剂

4.1  明胶磷酸盐缓冲液（GBS）：见附录A中A.1。

4.2  庖肉培养基（CMM）：见附录A中A.2。

4.3  胰蛋白酶胰蛋白胨葡萄糖酵母膏肉汤(TPGYT)：见附录A中A.3。

4.4  哥伦比亚血琼脂培养基：见附录A中A.4。

4.5  LB肉汤培养基。

4.6  LB琼脂培养基。

4.7  pMD19-Tvectorcloningkit。

4.8  JM109感受态细胞。

4.9  2×PfuPCR MasterMix。

4.10  氨苄青霉素。

4.11  IPTG。

4.12  X-Gal。

4.13  胶回收试剂盒。

4.14  DNA提取试剂盒。

4.15  革兰氏染液：见附录A中A.5。

4.16  标准菌株：丁酸梭菌CICC10390生孢梭菌CICC10385。

5   定性检验

6   操作步骤

6.1  增菌培养

接种前，先将CMM和TPGY培养基沸水中隔水煮沸10min-15min后，迅速放入冰或冰水浴中快速冷却。

取混匀后的食品样品25g于无菌均质袋内，加入35mL明胶磷酸盐缓冲液（1:1.5稀释，缓冲液加入比例可根据具体样品性状进行适量增减，原则上加入的稀释液体积越少越好），于匀浆器中充分混匀后，取2mL样液分别接种CMM和TPGYT培养基，每种培养基接种2管。若为风干样品，则加入明胶磷酸盐缓冲液室温浸泡60min后再进行匀浆及接种。

6.2  培养物检查

培养5天后，检查培养物的浊度、产气、肉粒消化及气味。如果培养5天的增菌液中没有细菌生长，则应继续培养10天。

6.3  菌的分离

6.3.1 增菌液前处理

取1-2mL增菌液于5mL灭菌离心管内，加入等量的无水乙醇，充分混匀， 室温静置1h。用接种环取经无水乙醇处理后的增菌液接种至哥伦比亚血琼脂平板内，35±1℃厌氧培养48-72h，培养期间严禁破坏厌氧环境。

6.3.2 典型菌落挑选

典型梭状芽孢杆菌在哥伦比亚血琼脂培养基上菌落多为白色或半透明，扁平、粗糙、蔓延根状生长或轮状生长，难刮除菌落；典型肉毒梭菌多为扁平圆形菌落，半透明，蔓延轮状生长，边缘整齐或不整齐，部分菌落可在短时间内蔓延长满整个平板。在分离平板上选择5个分离良好的典型菌落，分别再次接种哥伦比亚血琼脂平板，35±1℃厌氧培养48-72h。

6.4  革兰氏染色镜检

挑取纯培养后的细菌菌落，涂片革兰氏染色后镜检，观察菌落形态，并注意是否有典型的梭状菌、是否形成芽孢以及芽孢的位置等。同时对革兰氏阳性的纯培养物进行鉴定。

6.5  结果鉴定

6.5.1 生化鉴定

选择微生物全自动生化鉴定系统，VITEK 2 ANC TEST KIT鉴定卡，按操作说明进行鉴定。因人工判读误差较大，正确率低，不推荐使用API20A或Crystal Anaerobe ID 等商品化试剂条鉴定。

6.5.2 荧光PCR检测

表1 梭菌属鉴定用引物和探针序列

6.5.2.1 挑取革兰氏染色呈阳性梭状芽孢杆菌的二次传代纯培养后的新鲜菌落约20个，悬浮于1mL灭菌蒸馏水内，100℃煮沸10min后置于冰或冰水浴中迅速冷却，10000r/min离心2min 后备用。

6.5.2.2 每个反应的总体积为25μl，体系组分为：Probemastermix12.5μl，上游引物和下游引物各0.8μl，探针0.5μl，去除DNA酶和RNA酶的无菌水5.4μl，模板DNA5μl。反应条件：95℃10min，1个循环；95℃20s，60℃30s，72℃30s，45个循环。

6.5.2.3 判定标准：当空白对照Ct≥40，阴性对照Ct≥40，阳性对照Ct＜35，满足以上条件者检测结果 方有效。若样品Ct＜35，则判定样品中含有梭状芽孢杆菌属；若样品Ct≥40，则判定样品中不含梭状芽孢杆菌属；若35≤Ct＜40，需对样品进行重复实验，如重复结果仍然为35≤Ct＜40，则判定样品中不含有梭状芽孢杆菌属。

6.5.2.4 荧光PCR检测鉴定梭菌属阳性的菌株继续采用其它鉴定手段进一步鉴定到种，也可用商品化良润梭菌菌种鉴定试剂盒（PCR-探针法）进行梭状芽胞杆菌荧光PCR 鉴定。

6.5.3  微生物飞行时间质谱检测

运用飞行时间质谱对革兰氏染色阳性的纯培养物进行鉴定。注：飞行时间质谱无法对肉毒梭菌进行鉴定

6.5.4  16sRNA测序

6.5.4.1 细菌DNA提取

按照革兰氏阳性菌DNA试剂盒要求提取DNA。

6.5.4.2 基因扩增

通用引物对细菌16S RNA进行PCR扩增，阳性菌株电泳后按照胶回收试剂盒要求切胶回收。实验应设阴性及空白对照。引物及PCR扩增条件分离见表2、表3、表4。

表2 16 SRNA PCR反应引物序列

6.5.4.3  16SRNAPCR产物克隆

6.5.4.3.1 PCR产物与质粒连接：按照表5加入各反应物，16℃反应30分钟以上。

  表5 PCR产物连接

6.5.4.3.2 连接产物的转化

全量（10μL）加入至100μL JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。加入890μL SOC培养基，36±1℃振荡培养60分钟。

6.5.4.3.3 克隆产物筛选：

在含100μg/mL氨苄西林的LB琼脂培养基平皿上加入24mg/mL的IPTG 25μL，20mg/mL的X-Gal 50μL，无菌涂布均匀后避光保存备用。取6.6.3.2制备好的菌液100μL的菌液涂布于处理后的LB琼脂培养基平皿上，36±1℃避光培养16-18h后，挑取琼脂平板上的白色菌落接种于含有氨苄西林的LB肉汤，36±1℃振荡培养6h。

6.5.4.3.4 克隆产物PCR 确认

引物及PCR扩增条件见表6、表7及表8，其中反应总体积可根据实际需要进行调整。实验应设阴性及空白对照。

表6 PCR反应的引物序列

表7 PCR反应体系

表8 PCR反应条件

6.5.4.4 将经PCR确认克隆成功菌株进行测序，并比对基因序列。

注：16sRNA克隆测序结果不能将生孢梭菌和肉毒梭菌进行准确区分，因为生孢梭菌和A型、B型肉毒梭菌16sRNA序列有99%以上同源。

6.5.5  肉毒梭菌鉴定

疑似为肉毒梭菌的菌株需要需要检测毒素基因或进行动物实验确认。

6.5.5.1 肉毒毒素基因PCR检测

6.5.5.1.1细菌DNA提取：按照革兰氏阳性菌DNA试剂盒要求提取DNA。

6.5.5.1.2 基因扩增：采用针对A、B、E、F型肉毒梭菌肉毒毒素基因设计的通用引物进行PCR扩增。引物及PCR反应体系和参数见表8、表9和表10。反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当的调整。PCR检测时反应体系应设置阳性对照、阴性对照和空白对照。

表9 肉毒毒素基因PCR检测的引物序列

表10 肉毒毒素基因PCR检测的反应体系

表11 肉毒毒素基因PCR检测的反应参数

6.5.5.1.3  结果分析：电泳检测结果用凝胶成像系统记录。阴性对照和空白对照均未出现条带，阳性对照出现预期大小的扩增条带，待测样品出现预期大小的扩增条带，判定为PCR结果阳性；待测样品未出现预期大小的扩增条带，判定PCR结果为阴性。实验中设置的阴性对照、空白对照和阳性对照PCR检测结果应符合上述情况。否则，任一种对照如果出现非上述正常结果，应重做实验。 也可用商品化良润梭菌菌种鉴定试剂盒（PCR-探针法）进行肉毒梭菌荧光 PCR鉴定。

6.5.5.2   动物实验

按照GB4789.12-2016国标方法进行肉毒毒素检测鉴定肉毒梭菌。

7  菌株保存

短期（1个月）保存：可保存于CMM肉汤培养基内。取纯化后的菌落接种于CMM肉汤培养基内，于35±1℃厌氧培养48h-72h，待CMM肉汤培养基出现肉眼可见混浊后，于2-4℃冰箱保存。

中长期（1-2年）保存：可保存于磁珠保存管内。取纯化后的菌落接种于哥伦比亚血平板培养基内，于35±1℃厌氧培养48h-72h，用无菌棉签刮取适量菌落于磁珠管内混匀，吸除多余液体，于-80℃冰箱保存。为保证菌株的高存活率，建议使用进口磁珠。

长期（2-10年）保存：将菌株冷冻干燥后冷藏保存。取纯化后的菌落接种于哥伦比亚血平板培养基内，于35±1℃厌氧培养48h-72h后，向每个平板中加入1mL脱脂奶粉配成的冻存液，用L涂布棒刮取平板上菌落于冻存液内，继而吸取200uL放入冻干瓶内，冻干后于2-4℃冰箱保存。

8  结果与报告

8.1结果判定：依据6.5.1、6.5.2，6.5.3，6.5.4对梭状芽孢杆菌进行判定。

8.2结果报告：在25g（mL）样品中检出或未检出梭状芽孢杆菌。

9  注意事项

9.1 样品稀释：用明胶磷酸盐缓冲液稀释样品时，原则上稀释到适宜于接种即可。

9.2 由于牛肉粒会吸收部分水分，为了获取更多的增菌培养液，庖肉培养基制备时牛肉粒不宜放入过多。

9.3 隔水煮沸增菌培养基时，应在试管内的培养基沸腾后开始计时10-15min。向含有增菌液的试管内接种样品时，尽量靠近试管底部接种，并避免接入气泡和搅动。

9.4 为便于培养期间观察，建议尽量用透明厌氧装置培养，培养期间严禁打开厌氧装置破坏厌氧环境。

9.5 为了检验培养环境的厌氧情况，培养过程中应在厌氧装置中放入厌氧指示剂。

9.6 增菌过程中加入液体石蜡是为了保证提供充分的厌氧环境，若培养过程中使用的厌氧装置密闭性好也可以不加液体石蜡封闭。取增菌液划平板时应小心用移液器慢慢吸出增菌液于另一容器内再划线，并尽可能去除液体石蜡，不推荐使用接种环直接从用液体石蜡封闭的增菌液中取样直接划平板。