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1 方法来源
GB 4789.29-xxxx《食品安全国家标准 食品微生物学检验 唐菖蒲伯克霍尔德氏菌检验》。
2 适用范围
本程序规定了食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的检验方法。
3 设备和材料
3.1 实验室常规灭菌设备。
3.2 冰箱：2℃～8℃、-20℃～-30℃。
3.3 恒温培养箱：26℃±1℃、36℃±1℃。
3.4 恒温水浴锅：46℃±1℃。
3.5 显微镜：10倍～100倍。
3.6 均质器。
3.7 离心机：3000r/min。
3.8 电子天平：感量0.1g。
3.9 比浊计。
3.10 锥形瓶：容量100 mL、500 mL。
3.11 无菌培养皿：直径90mm、直径150mm。
3.12 无菌透明玻璃纸、滤纸。
3.13 无菌灌胃器：1mL。
3.14 微生物生化鉴定系统。
3.15 小鼠：18g～20g，每一批次试验应使用同一品系的KM或ICR小鼠。
4 培养基和试剂
4.1 GVC增菌液：见A.1。
4.2 改良马铃薯葡萄糖琼脂（mPDA）：见A.2。
4.3 PCFA培养基：见A.3。
4.4 马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）：见A.2.1。
4.5 马铃薯葡萄糖半固体琼脂：见A.4。
4.6 卵黄琼脂：见A.5。
4.7 革兰氏染色液：见A.6。
4.8 氧化酶试剂：见A.7。
4.9 Hugh-Leifson培养基（O/F试验用）：见A.8。
4.10 蛋白胨水（靛基质试验用）：见A.9。
4.11 缓冲葡萄糖蛋白胨水（MR和VP试验用）：见A.10。
4.12 西蒙氏柠檬酸盐培养基：见A.13。
4.13 苯丙氨酸培养基：见A.14。
4.14 糖发酵管：见A.15。
4.15 半固体琼脂：见A.16。
4.16 抗O多价血清、型特异性因子血清（O-Ⅲ、O-Ⅳ、O-Ⅴ、O-Ⅵ、O-Ⅶ型、O-Ⅷ型）。
4.17 生化鉴定试剂盒。
5 检验程序
唐菖蒲伯克霍尔德氏菌检验程序见图1。
6 操作步骤
6.1 样品处理
无菌操作称取25g（mL）样品，置入盛有225mLGVC增菌液的无菌均质袋中（鲜银耳样品取1g，用剪刀剪碎，加入盛有20mLGVC增菌液的无菌均质袋中），用拍击式均质器拍打1min～2min；或置入盛有225mLGVC增菌液的无菌均质杯中，以8000r/min～10000r/min均质1min～2min；若样品为液态，振荡混匀。
6.2 增菌
将上述样品增菌液置36℃±1℃培养20h～24h。
6.3 分离
用直径3mm的接种环取增菌液一环，分别划线接种于mPDA平板和PCFA平板，36℃±1℃培养24 h～48 h。观察各个平板上生长的菌落，各个平板上菌落特征见表1。
表1 唐菖蒲伯克霍尔德氏菌在不同分离平板上的菌落特征
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培养基 |
菌落特征 |
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mPDA 平板 |
培养24 h后，菌落1 mm～2 mm，紫色，光滑、湿润、边缘整齐。培 养48 h后，部分菌落中心可有凸起呈草帽状。 |
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PCFA 平板 |
培养24h后，菌落0.5mm～1mm，灰白色，光滑、湿润、边缘整齐。 |
|
卵黄琼脂平板 |
培养24 h后，菌落2 mm～3mm，表面光滑、湿润，培养48 h后，菌 落周围形成乳白色混浊环，斜射光下可见菌落及周围培养基表面呈虹彩现象。 |
6.4 初筛试验
自选择性琼脂平板上分别挑取5个以上典型或可疑菌落（低于5个全选），分区划线接种于卵黄琼脂平板，36℃±1℃培养。挑取培养18～24 h的菌落进行革兰氏染色及氧化酶试验。对于革兰氏染色阴性、氧化酶试验阴性的菌继续培养至48 h±2 h，对于卵磷脂酶阳性，带有虹彩环的单个菌落，接种PDA平板，36℃
±1℃培养24 h±2 h。
6.5 生化试验
从纯培养的PDA平板上挑取菌苔进行生化鉴定。唐菖蒲伯克霍尔德氏菌生化特征见表2。可选择生化鉴定试剂盒或微生物生化鉴定系统。
表2 唐菖蒲伯克霍尔德氏菌生化特征
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生化试验 |
特 征 |
|
O/F 试验（氧化型） |
+ |
|
氧化： |
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葡萄糖 |
+ |
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果糖 |
+ |
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木糖 |
+ |
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半乳糖 |
+ |
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蔗糖 |
- |
|
阿拉伯糖 |
+ |
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甘露醇 |
+ |
|
侧金盏花醇 |
+ |
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肌醇 |
+ |
|
卫茅醇 |
+ |
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动力 |
+ |
|
卵磷脂酶 |
+ |
|
氧化酶 |
- |
|
尿素 |
+ |
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明胶液化 |
+ |
|
硝酸盐还原 |
+ |
|
柠檬酸盐利用 |
+ |
|
精氨酸 |
+ |
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石蕊牛乳 |
+ |
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靛基质 |
- |
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V-P |
- |
|
MR |
- |
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苯丙氨酸脱氨酶 |
- |
|
H2S 产生 |
- |
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注：＋表示阳性;－表示阴性。 |
|
6.6 血清学分型鉴定（可选择项）
6.6.1 菌体抗原的制备
将PDA平板36℃±1℃培养24 h±2 h 的培养物用无菌生理盐水洗下，沸水浴（100 ℃）2h，3000r/min10min离心弃上清液，再用无菌生理盐水稀释至5×108～109 CFU/mL菌悬液，作为凝集试验用抗原。
6.6.2 菌体抗原的鉴定
用多价血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。与多价血清凝集者， 依次用O-Ⅲ、O-Ⅳ、O-Ⅴ、O-Ⅵ、O-Ⅶ、O-Ⅷ因子血清做试管凝集试验。根据试验结果，判定菌体抗原型。在生理盐水中自凝者不能分型。生化特征符合，但不能与以上血清凝集者，需保留菌株做进一步鉴定。
6.7 毒性试验
6.7.1 产毒培养
将初步鉴定为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的菌株接种PDA平板，36℃±1℃， 培养24 h±2 h，用灭菌接种环刮取适量菌苔，加到3mL无菌生理盐水的试管中， 配成1麦氏浓度（McFarland，MCF）的菌悬液（约为108CFU/mL），用无菌吸管吸取0.5mL，滴在铺好无菌玻璃纸的直径150 mm马铃薯葡萄糖半固体平板上，用无菌L棒涂布均匀，26℃±1℃培养5 d。取下带菌的玻璃纸，将半固体平板置于100℃流动蒸汽灭菌30 min。室温冷却后，置-20℃～-30℃冰箱过夜。将冰冻好的半固体平板置室温融化，用无菌吸管吸出冻融液，经滤纸过滤至无菌试管或锥形瓶中（此为毒素粗提液），4℃避光保存。
同时，将未接种菌苔、铺好无菌玻璃纸的直径150 mm马铃薯葡萄糖半固体平板作为阴性对照，按照同样的试验方法制备阴性对照粗提液，4℃避光保存。
6.7.2 毒力测定
取毒素粗提液或经100℃水浴蒸发后的5～10倍浓缩液，灌胃小鼠3只，每只 0.5 mL，观察至7 d。若菌株产生米酵菌酸，小鼠在灌胃后20 min～24 h内发病。主要症状为竖毛、萎糜不振、躁动，继而行步蹒跚、肢体麻痹、瘫软、抽搐，呈角弓反张状，呼吸急促、死亡。
取阴性对照粗提液或经100℃水浴蒸发后的5～10倍浓缩液，灌胃小鼠3只， 每只0.5 mL，观察至7 d。小鼠应健康存活。
6.7.3 米酵菌酸测定
毒力测定实验阳性时，分别取毒素粗提液，阴性对照粗提液，按照GB 5009.189执行。
7 结果报告
生化试验符合且毒性试验阳性,报告检出唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（椰毒假单胞菌酵米面亚种）；生化试验和毒性试验有一项不符合,报告未检出唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（椰毒假单胞菌酵米面亚种）。
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