一、琼脂介绍

  琼脂是由植物中提取的一种多糖，主要来源于海生藻类植物。在微生物培养基中，琼脂一般只做为凝固剂使用，流体状培养基中琼脂的添加量一般为0.5-2g/L（琼脂使培养基具有一定黏度，阻止液体对流，常用于厌氧菌的培养），半固体培养基中琼脂的添加量一般为3.5-4g/L（常用于菌种保存、动力试验等），植物组织培养基中琼脂的添加量一般为5-10g/L，固体培养基中琼脂的添加量一般为12-15g/L。

  琼脂粉一般为白色、淡黄色或淡灰色粉末状，在冷水中不溶解，加热煮沸或高压灭菌可使琼脂溶解（多数琼脂的熔点在90℃左右），冷却后可凝成固态（多数琼脂的凝固点在40℃左右），反复加热和冷却虽然可以使琼脂在液态和固态多次转换，但琼脂的凝胶强度会越来越低。

二、琼脂培养基的制备和使用方法

  （1）按照培养基标签，称取适量培养基干粉溶解于纯化水中，加热煮沸至琼脂完全溶解，分装试管或锥形瓶；

  （2）将分装后的培养基置于规定的条件下进行灭菌处理（加热灭菌的培养基可反复煮沸4-6次至培养基完全溶解，倾入平皿中制成平板使用）；

  （3）灭菌结束后，待培养基冷却至50℃左右，可置于47-50℃水浴保温（可根据实际培养基凝固温度适当提高水浴温度），放置时间一般不应超过4小时；

  （4）临用前，加入相应的添加剂成分，摇匀后倾入平板，凝固后备用；或制成斜面、倾注使用等。

三、注意事项

  （1）溶解干粉时，建议水温在40℃以下，最高不超过60℃。琼脂在遇到热水时，表面易吸水变硬，结成硬块，不利于分散溶解。因此在进行干粉溶解时，宜用冷水，并不停搅拌至分散均匀无团块，再进行加热处理；

  （2）灭菌前需进行加热煮沸使琼脂完全溶解，分散均匀，方可进行分装试管或锥形瓶，否则分装后可能出现琼脂分布不均，凝固性不一；灭菌前的加热煮沸溶解同时有助于加快高压灭菌过程的热穿透，提高灭菌效果，降低灭菌失败的几率；

  （3）已凝固的培养基不可以再次高温高压灭菌。若培养基内成分较稳定，可重新沸水浴溶化一次使用；

  （4）需添加抗生素或其他不稳定成分的培养基，需在临用前，待培养基冷却至50-55℃时加入，过早或过热时加入这些成分，易导致不稳定成分分解，降低培养基使用效果；

  （5）已凝固的培养基不可反复多次加热溶化使用。反复加热易使培养基内营养成分分解，琼脂的凝胶强度下降，一般成分较稳定的培养基允许溶化一次使用。

  （6）已凝固的培养基，不可在结冰条件下保存。培养基结冰会使琼脂内部结构破坏，导致失水或凝固性变差，琼脂变性。

四、常见问题解答

 （1）灭菌前培养基没有进行加热煮沸溶解，结果发现灭菌后的培养基制成的平板部分凝固性不好，或瓶内的培养基出现分层现象（底层凝固，上层不凝固），是怎么回事？

  答：这是由于琼脂分布不均导致的。琼脂的比重较大，易下沉至底部，高压灭菌后虽然从外观上看培养基澄清透明，琼脂已经完全溶解，但实际上琼脂仍然集中溶解在底部，导致上层含有极少量琼脂，下层含有大量琼脂，因此制成的平板会出现部分不凝固或凝固不完全的现象，瓶内的培养基冷却后出现分层，下层因含大量琼脂而呈固态，上层琼脂少呈液态。在灭菌前若加热煮沸使琼脂完全溶解分布均匀，灭菌后就不会出现此现象。若灭菌前未进行加热溶解，则灭菌后使用前需充分摇匀，确保溶解在底层的琼脂均匀分散开，也可避免出现平板不凝固或凝固不均匀的问题。

  此外，偏酸的环境不利于琼脂的凝固。因此在制备一些pH偏酸的培养基时（pH＜4.5），需将琼脂与其他成分分开灭菌，冷却至50℃左右再混合均匀制成平板。在培养基的制备时若出现琼脂不凝固，也有可能是因为配制或灭菌过程出现问题，导致培养基的pH过低，琼脂不能凝固。

 （2）灭菌后的琼脂培养基若未用完，可以下次再重新溶化继续使用吗？

  答：《GB4789.28 -2013培养基的试剂和质量要求》标准中指出，“含有活性化学物质或不稳定性成分的固体培养基也应即配即用，不可二次融化”；因此对于一些已添加抗生素、卵黄、血清等不稳定成分的培养基，不可以再次融化使用。而对于一般的培养基，可使用沸水浴或采用有相同效果的方法使培养基融化，再次融化后未用完的培养基则不能重新凝固留待下次使用。

 （3）已经制备好的固体培养基平板，可以保存多久使用？应如何保存？

  答：《GB4789.28 -2013培养基的试剂和质量要求》标准中指出，“在保证其成分不会改变条件下保存，即避光、干燥保存，必要时在5℃±3℃冰箱中保存，通常建议平板不超过2周～4周，瓶装及试管装培养基不超过3个月～6个月，除非某些标准或实验结果表明保质期比上述的更长。”“建议需在培养基中添加的不稳定的添加剂应即配即用，除非某些标准或实验结果表明保质期更长；”“培养基的贮存应建立经验证的有效期。观察培养基是否有颜色变化、蒸发（脱水）或微生物生长的情况，当培养基发生这类变化时，应禁止使用。”

  因此，对于含有不稳定成分的培养基平板，最好是现配现用，除非经过效期验证，可适当延长保存期限（可以在2-8℃保存或验证过的温度下保存）；一般较稳定的培养基可在适宜条件下保存2-4周（一般建议在10-25℃左右的环境保存，温度过低时培养基易出现冷凝水，温度过高易导致培养基失水及部分营养成分失效），或通过有效期验证延长保存期限；若保存后的培养基出现明显外观变化或污染微生物，则不能使用。不可在0℃以下结冰保存。

 （4）灭菌后的培养基，在47-50℃呈液态状可以保存多久？是否可以过夜或更长时间保存？对培养基性能会有影响吗？

  答：《GB4789.28 -2013培养基的试剂和质量要求》标准中指出，“融化后的培养基放入47℃～50℃的恒温水浴锅中冷却保温(可根据实际培养基凝固温度适当提高水浴锅温度)，直至使用，培养基达到47℃～50℃的时间与培养基的品种、体积、数量有关。融化后的培养基应尽快使用，放置时间一般不应超过4 h。”

  多数培养基中含有蛋白胨、酵母浸粉、葡萄糖等成分，蛋白胨、酵母浸粉中含有多种维生素、微量元素等营养成分，在长时间处于较高温度下保存易导致这些营养成分降解，而长时间热保温条件下的葡萄糖则易分解焦化，导致培养基pH下降。因此，长时间的保温会使培养基的营养成分流失，灵敏度下降，培养效果变差，琼脂的凝胶强度也会降低。保温过夜或更长时间这种操作方法是不规范的，应当按照标准要求，在保温4h内使用。

 （5）按照标准进行培养基配制时，有时候制成的平板凝胶强度较低，可否增加琼脂含量来提高平板的凝胶强度？是否会对微生物的生长造成不良影响？

  答：目前市场上的销售的琼脂来源、工艺、纯度等各方面存在差异，导致不同的琼脂凝胶强度存在差别。因此在《GB4789.28 -2013培养基的试剂和质量要求》标准中也明确指出，允许“根据所需凝胶作用的效果改变琼脂的用量”。

  琼脂在培养基中，主要起固化的作用，因此适量的增加或减少琼脂含量并不会对微生物生长造成不良影响。但要注意，在使用半固体琼脂观察动力时，若要进行琼脂调整，需进行试验验证，若培养基添加琼脂过多，凝胶强度偏高，会导致部分细菌动力效果不明显；而对于制成平板的固体培养基，适量调整琼脂不会对培养基的灵敏度和生长率造成不利影响（即不影响微生物的生长和计数），但若琼脂过多，平板偏硬，会使菌落稍偏小；若琼脂偏少，平板偏软，会使一些动力强的细菌菌落稍大，甚至蔓延，划线接种时也会出现易划破平板的问题。

 （6）平板进行涂布接种或划线接种时，经常出现菌落片状生长或蔓延，是什么原因？

  答：通常是由于平皿表面水过多导致的。刚制备好的平板，可进行适当的干燥处理，在培养箱中预培养2h左右或在超净工作台中开盖中风吹15-30min，降低平板表面的含水量。进行涂布操作时，9cm平板建议接种量为100μL，最高不超过200μL。

 （7）平板在培养箱中培养后，有的平板干裂严重，有的平板出水严重，是什么原因？如何解决？

  答：主要与琼脂的保水性和弹性、平板厚度、平皿的透气性、培养箱条件有关。

  琼脂：不同的琼脂在保水性方面略有差异，而琼脂的弹性会影响是否开裂。弹性差的琼脂在大量失水后，易出现开裂；而弹性好的琼脂在大量失水后，易出现变薄或缩小现象。

  平板厚度：平板越薄越容易干裂。通常使用的平板培养基厚度为2-3mm，若培养时间较长或干裂问题较严重，可适当增加培养基厚度。

  平皿的透气性：新制备的平板一般不容易出现干裂问题，而长时间保存的平板更容易出现干裂现象，这主要与平板的透气性有关。平板的密封性越好，保存和培养过程中培养基失水越少。虽然增加平板的密封性可以减少水份流失，但并非密封性越高越好。一些需氧型微生物（如铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌），在密闭环境中生长较差，需要良好的透气性才能较好的生长。而对于一些生化鉴定类培养基平板（如XLD平板），细菌的生长和生化反应的发生需要有氧气参与，密闭的平皿反而会得到较差的实验结果。因此在选用平皿时，需结合实际情况选择合适透气性的平皿。

  培养箱条件：培养箱是影响平皿干裂问题的关键因素之一。大型的培养箱为了保证内部温度均一，通常带有较强的鼓风系统，内部有较强的空气流动。而气流越强，则越容易导致平皿失水。而对于一些没有鼓风系统的小型培养箱，则很少会出现平皿干裂现象。在培养箱内摆放平皿时，应尽量避开风口气流大的位置，同时远离培养箱内部发热板。

  因此，在遇到平板干裂问题时，可通过增加平板培养基厚度、培养箱内增加挡板降低气流或避开风口、选择合适透气性的平皿、减少使用长期存放的平板等方面进行解决。

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