一些细菌在生长过程中，可以产生溶血素，使红细胞破裂溶解，在血平板上生长时，菌落周围可观察到透明或半透明的溶血环，许多细菌的致病性都与溶血特性相关。由于不同细菌产生的溶血素不同，溶血能力也不相同，在血平板上的溶血现象也不相同，因此，溶血试验常用来进行细菌的鉴定。

（1）α溶血、β溶血和γ溶血

  α溶血又称草绿色溶血，在菌落周围可观察到1~2mm的草绿色半透明溶血环，为高铁血红蛋白所致，α溶血环中的红细胞未完全溶解，是一种不完全溶血现象，常见的产生α溶血的菌株为肺炎链球菌、甲型溶血性链球菌。

图1 肺炎链球菌在血平板上的α溶血现象

  β溶血又称为完全溶血，在菌落周围可观察到2～4mm界限分明、完全透明的溶血环。β溶血环中的红细胞完全溶解，是细菌产生的溶血素使红细胞完全溶解所致，许多致病性强的菌株都可形成β溶血，如乙型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌等。γ溶血即不溶血，菌落周围无溶血现象。

  注：制作溶血试验用的血平板，特别是金黄色葡萄球菌的溶血试验，通常选用脱纤维绵羊血。这是因为绵羊红细胞的细胞膜中的神经鞘磷脂含量较高，金黄色葡萄球菌产生的β溶血素作用于神经鞘磷脂裂解红细胞，试验中更易观察到溶血现象。

图2 金黄色葡萄球菌的β溶血和粪肠球菌的γ溶血

注：部分金黄色葡萄球菌不表现β溶血

图3 蜡样芽胞杆菌的β溶血

注：部分蜡样芽胞杆菌表现为α溶血

图4 产气荚膜梭菌的β溶血

注：产气荚膜梭菌有两种溶血素，能产生双溶血环，在β溶血环外围可隐约看到宽度约为3-5mm的不透明微弱溶血环

（2）李斯特氏菌溶血试验

图5 李斯特氏菌溶血试验

  单增李斯特氏菌的溶血现象较弱，直接采用划线接种方法时在血平板上较难观察到溶血现象，因此在《GB4789.30-2016单核细胞增生李斯特氏菌检验》标准中，采用穿刺接种法可以更好的观察到李斯特氏菌的溶血现象，单增李斯特氏菌、斯氏李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌可观察到明显的β溶血环，英诺克李斯特氏菌无溶血。

（3）协同溶血试验（CAMP）

  一些细菌能产生CAMP因子，可促进葡萄球菌的β-溶血素溶解红细胞的活性，因此在两菌的交界处溶血力增加，出现箭头状或半月状透明溶血区域。该试验常用于B群链球菌的鉴定，也用于单增李斯特氏菌的鉴定。

试验方法：挑取金黄色葡萄球菌ATCC25923在血平板上划平行直线，再挑取待测菌株垂直划线，距离金黄色葡萄球菌接种线约1mm但不要接触，置于36℃培养24-48h。

注：为何使用金黄色葡萄球菌ATCC25923做协同溶血试验，而不是任意一株金黄色葡萄球菌都能做？

  金黄色葡萄球菌发生溶血主要靠四种溶血素：α、β、γ和δ。其中α、γ和δ溶血素又称为“打孔毒素”，在细胞膜上形成孔道，小分子和离子可以自由进出细胞，导致细胞代谢发生紊乱，最终发生裂解。而β溶血素的溶血机理不同，是通过水解细胞膜的鞘磷脂裂解细胞。多数金黄色葡萄球菌都有两种以上的溶血素基因高效表达，在血平板上可观察到完全透明的β溶血环，少数金黄色葡萄球菌只有β溶血素基因高效表达或无溶血素基因表达，在血平板上微弱溶血或不溶血。

  金黄色葡萄球菌ATCC25923是一株表型不完全溶血的菌株，该菌主要产生β溶血素，在血平板上溶血现象非常微弱。B群链球菌可以产生一种CAMP蛋白（非酶蛋白），可以与β溶血素协同作用快速裂解红细胞，产生溶血现象。因此，在靠近金黄色葡萄球菌ATCC25923的B群链球菌周围可以观察到明显的溶血增强现象。而其他金黄色葡萄球菌若不产生β溶血素或本身产生多种溶血素形成了完全透明的β溶血，则无法发生协同溶血或无法观察到协同溶血现象。

图6 无乳链球菌（B群链球菌）协同溶血试验

图7 李斯特氏菌协同溶血试验

（4）神奈川现象

  该试验是副溶血性弧菌特有的溶血现象，副溶血性弧菌在普通血平板上不溶血或只呈现α溶血，但在含高盐（7%）的人O型血或兔血以及D-甘露醇做为碳源的我妻氏琼脂平板上可产生β溶血。副溶血性弧菌致病性越强，溶血现象越明显。

图8 神奈川试验现象（左为副溶血性弧菌，右为溶藻弧菌）

（5）培养基的选择及制备注意事项

  在《GB4789.10-2016金黄色葡萄球菌检验》标准中，使用的是豆粉琼脂加5%-10%的脱纤维羊血或兔血；在《GB4789.11-2014β型溶血性链球菌检验》标准中，使用的是哥伦比亚血琼脂基础加5%脱纤维绵羊血；在《GB4789.14-2014蜡样芽胞杆菌检验》标准中，使用的是胰酪胨大豆羊血琼脂；在《GB4789.30-2016单增李斯特氏菌检验》标准中，使用的是5%-8%的羊血琼脂。其他文献或标准中也有使用TSA或BHI补加5%-10%脱纤维羊血做成的血琼脂。以上培养基做出来的效果基本一致，本质上都是观察溶血效果，选择哪种培养基并不影响结果观察（注：神奈川试验使用的是单独的我妻氏培养基加入兔红细胞制成的平板，该培养基不能用于其他溶血试验观察）。

注意事项：

1.血液要选用新鲜的无菌脱纤维血，制备如血液出现变色则不能使用。

2.配制培养基时，应预先将血液温育到40-50℃左右，待培养基冷却至50℃左右时加入血液，轻轻摇匀。若血液与培养基温差过大，制成的平板易出现凝块。若摇晃幅度过大，易产生大量气泡，制成的平板不平整。

3.血液对温度比较敏感，加入血液时培养基温度不能过高，加入血液混匀后应立即倒平板，不能长时间保温，否则会导致制成的平板颜色偏深。

4.制成的平板不宜过厚，15mL-20mL为宜，平板过厚不利于观察溶血环。

5.制成的平板应在2-8℃左右低温冷藏，不宜储存过久，若储存过程发现平板变黑或变透明，则不能使用。

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