这是一种最早发展而且目前仍广泛使用的方法。在DNA重组载体设计时已经在质粒中装配了抗生素抗性基因标记，如四环素抗性基因（Tet^r）、氨苄青霉素抗性基因（Amp^r）、卡那霉素抗性基因（Kan^r）等。当编码有这些抗药性基因的质粒携带目的基因进入宿主细胞后，细胞就具有了相应的抗生素抗性，如果在筛选平板的培养基中加入有关抗生素，只有含质粒的细胞才能生长。这种方法只能证明细胞中确实已经有质粒存在，但无法保证质粒中已经携带了目的基因。为了防止误检，人们进一步发展了采用插入缺失的方法，同一质粒中往往有两种抗药性基因，在体外重组时故意将目的DNA插入到其中一个抗性基因中，使其失活，这样得到的宿主细胞便可在含另一抗生素的培养基中存活，但在两种抗生素都加入的平板上则不能生长。将这种菌株筛选出来，就能保证细胞中的重组质粒确实已经插入了目的基因。由于需要两次筛选，操作比较麻烦。