工具酶从20世纪40年代至60年代，从理论上已经指出了基因体外重组的可能性，但科学家们面对庞大的双链DNA分子束手无策，无法根据需要将DNA分子切割成单个的基因片段，也无法将两个DNA片段正确地连接起来。限制性核酸内切酶的发现解决了DNA分子的切割问题，1970年，Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）中分离并纯化了限制性核酸内切酶Hind Ⅱ；1972年，Boyer实验室发现了Eco R I核酸内切酶，能够识别核苷酸链上的GAATTC序列；从此以后，相继发现了各种类似于Eco R I的限制性核酸内切酶，它们可以在特殊的位点切割DNA分子，因此，有人将限制性核酸内切酶形象地称为“长眼睛的剪刀”。

几乎与此同时的另一项重要发现是DNA连接酶。1967年，世界上有5个实验室几乎同时发现了DNA连接酶。这种酶能够将DNA的裂口修复，将两条DNA片段按预定的方向重新连接在一起。1970年，美国Khorana实验室发现了具有更高连接活性的T₄ DNA连接酶。可以毫不夸张地说DNA连接酶就是重组DNA的“缝纫针和线”。