基因是具有遗传功能的DNA分子上的片段，平均长度约1000bp。早在1946年就有人提出了“一个基因一种酶”的理论，即一个基因经转录、翻译后将表达一种蛋白质分子。一个完整的基因应该包括：结构基因、调节基因、操纵基因、启动基因和终止基因，其中结构基因含有所表达蛋白质的全部信息。基因工程的目的是将性状优良的相关基因进行重组获得具有高度应用价值的新物种。因此，基因工程的首要任务是从现有生物群体中分离出特定的目的基因，目的基因一般都是结构基因。通过目的基因将所需的外源遗传信息额外流入宿主细胞中，使宿主表现出所需要的性状。因此理想的目的基因应不含多余的干扰成分、纯度高，而且片段大小应适合重组操作。

最传统的获得外源基因方法是手枪克隆法（shortgun cloning）。若对细胞的基因信息一无所知，从细胞中提取的DNA分子用若干种限制性内切酶切割成片段，将这些片段进行分离后分别克隆到宿主细胞进行表达，从表达产物中鉴别每一DNA片段的生物活性以确定是否含有所需要的目的基因。显然这种方法的工作量非常大。

从20世纪60年代起，科学家就开展了测定DNA分子中核苷酸排列序列方法的研究工作，但是进展不大。1975年Sanger等人发明了加减法，能够直接分析100～500个核苷酸的 DNA 片段，取得了DNA测序的重大突破。1977年Maxam和Gilbert等人发明了化学降解法，能够更快速地分析DNA序列。同年Sanger等人又提出了双脱氧链终止法，该方法能快速、准确、可靠地测量DNA序列，是目前DNA序列分析的重要手段。随着计算机技术的快速发展，20世纪80年代实现了DNA的自动测序，从而人类能够从各种生物体的 DNA中得到海量的序列信息，相继完成了人类基因组、水稻基因组及许多微生物基因组的测序，为基因的发现、合成和分离奠定了物质基础。通过几十年来的努力和数据积累，世界上已经建立了多个基因库和基因文库。