一、简介

  在实验室检验工作中，经常会从样品中分离出一些细菌，为了对这些细菌进一步研究，首先需要明确这些细菌的种属类别。本文主要对未知菌种属分类的确定方法进行阐述。

  目前基因测序是最直接快速的菌种确定方法。但是实验室中，往往还需要采用传统的鉴定方法进行菌种鉴定。传统鉴定方法操作简单，成本低廉，不需要复杂设备，适用于一般实验室进行菌株鉴定。

二、常见细菌的鉴定方法

  菌种鉴定是需要专业人员进行操作的一种实验室活动，为了达到菌种鉴定的目的，一些常规的试验操作和鉴定方法是必须具备的基本技能。常见的细菌鉴定方法有三大类：形态特征、培养及生理特性、生化特性测定。

  1、形态特征

  （1）革兰氏染色

  （2）鞭毛染色

  （3）运动性

  （4）芽孢染色

  （5）抗酸染色

  （6）荚膜染色

  2、培养及生理特性

  （1）菌落形态：用划线法将菌种接在平板培养基上，适温培养1d～2d，出现单菌落开始观察，包括形状、大小、边缘、表面、隆起、透明度、菌落和培养基的颜色等。

  （2）生长温度和耐热性：将菌种转接到几支试管中，分别在不同温度下培养，每个温度设2管，目测生长情况。

  （3）芽孢菌厌氧性测定：将菌种用接种环穿刺接种在厌氧培养基中，30℃培养，3d和7d分别观察，表面生长者为好氧菌，如沿穿刺线或下部生长者为兼性厌氧菌或厌氧菌。

  （4）碳源利用：将菌种接种在各种碳源基础液体培养基（碳源分别为蔗糖、乳糖、果糖、木糖、半乳糖、甘露醇等，终浓度为0.1%～0.2%）中，适温培养1d，以菌悬液接种，能生长者即培养基变浑浊判为阳性，否则为阴性。

  （5）氮源利用：将菌种接种在各种氮源基础液体培养基（氮源分别为氨态氮如磷酸氢二铵或硝态氮如硝酸钾、乳糖、果糖、木糖、半乳糖等，终浓度为0.2%～0.5%）中，适温培养1d，以菌悬液接种，能生长者即培养基变浑浊判为阳性，否则为阴性。

  （6）柠檬酸盐利用：将菌种接种在柠檬酸盐基础液体培养基总，适温培养3d～7d，培养基变为桃红色者判为阳性，否则为阴性。

  （7）耐盐性和需盐性：将菌种分别接种在含3%，5%，7%，10%含NaCl的肉汁胨液体培养基中，适温培养3d、7d，目测生长情况。

  （8）丙酸盐利用：将菌种接种在丙酸盐基础液体培养基中，适温培养3d～7d，培养基变为桃红色者判为阳性，否则为阴性。

  3、生化特性测定

  （1）氧化酶：将1%的四甲基对苯二胺水溶液滴于干净培养皿的滤纸上，滤纸湿润即可，用塑料接种环取18h～24h的菌苔涂抹于湿润滤纸上，在10s内涂抹的菌苔呈蓝色为阳性，60s以上呈蓝色者不计，按阴性处理。

  （2）触酶：将24h培养的斜面菌种，用塑料接种环取菌苔涂抹于已滴有3%过氧化氢的玻片上，如有气泡产生则为阳性，无气泡产生为阴性。

  （3）葡萄糖氧化发酵：将24h幼龄菌种穿刺接种OF培养基，每株4支，其中2支上面覆盖石蜡油，适温培养1d、3d、7d、14d观察，只有开管变黄者为氧化型，开管和闭管均变黄者为发酵型。

  （4）甲基红（MR）：培养48h的菌种试管培养液中加入一滴甲基红试剂，红色为甲基红阳性反应，黄色为阴性反应。

  （5）V-P测定：将培养24h的菌种培养液，加入V-P试剂，培养液出现红色，即为试验阳性反应，有时需要放置更长时间才能出现红色。

  （6）淀粉水解：将菌种接在淀粉琼脂培养基（在肉汁胨中加入0.2%的可溶性淀粉）上，培养2d～5d，形成明显菌落后，将碘液滴在平板上，观察菌落周围有无透明圈。菌落周围如有不变色的透明圈，表示淀粉水解阳性；仍蓝色为阴性。

  （7）脲酶：指示剂变红者为阳性，不变为阴性。

  （8）苯丙氨酸脱氨酶：变绿为阳性反应，不变为阴性反应。

  （9）明胶液化：将菌株接种在明胶液化培养基中，25℃～28℃培养，于5d、10d、20d、30d观察液化程度。

  （10）牛奶分解：将新鲜菌种接于石蕊牛奶中，25℃～28℃培养，于3d、5d、10d、20d、30d观察，还原-石蕊褪色变白；胨化-牛奶变清；产酸-石蕊变红；产碱-石蕊变蓝；酸凝和酶凝-牛奶结块、凝固。

  （11）硝酸盐还原：将菌种接种于硝酸盐液体培养基中，适温培养1d、3d、5d。用滴加A液及B液溶液变为粉红色、橙色、棕色等为硝酸盐阳性，否则为阴性。

上面列出的只是一些常用的生化反应，能帮助细菌鉴定的生化试验有四十多种，需要时可以查阅资料进行操作。

三、示例说明

  下面以伯杰手册为依托，详细事例说明未知细菌的鉴定程序和方法。

  1、十大类群的确定

图1  常见细菌类群检索总图

  参考“常见细菌类群检索总图”（图1），首先通过测定细胞壁是否含肽聚糖、膜脂是否以脂键相连，确定待鉴定菌为真细菌还是古细菌。

  对于确定是真细菌的菌株，依次通过对光的需求性、产芽孢情况、革兰氏染色结果和对氧气的需求情况，确定出属于哪个大类群。细菌九大类群如下：

  （1）光合细菌

  （2）产芽孢细菌

  （3）好氧或兼性厌氧发酵型革兰氏阴性杆菌

  （4）好氧或兼性厌氧非发酵型革兰氏阴性杆菌

  （5）严格厌氧的革兰氏阴性球菌

  （6）革兰氏阴性、厌氧直杆、弯杆和螺杆菌

  （7）革兰氏阳性好氧和兼性厌氧球菌

  （8）好氧和兼性厌氧的革兰氏阳性杆菌

  （9）厌氧的革兰氏阳性杆菌和球菌

  2、对于已经确定了大类群的细菌，再按照所属大类的检索图进一步确认其所属的种属。例如，通过第一步操作，确定该菌为“好氧或兼性厌氧发酵型革兰氏阴性杆菌”，则可以通过“好氧或碱性厌氧革兰氏阴性发酵杆菌检索图（图2）”，进行氧化酶试验、鞭毛运动性、是否寄生于脊椎动物鸟类、最适温度<30℃、是否需要NaCl、是否积累PHB、是否具有脂酶、能否利用甘露醇等试验，进一步找到其所在的科或属。

  从图2可以看出，好氧或兼性厌氧发酵型革兰氏阴性杆菌类群中共包含7大科属，分别为肠杆菌科、巴斯德氏菌科、水栖菌属、发光杆菌属、弧菌属、气单胞菌属和邻单胞菌属。

图2  好氧或兼性厌氧革兰氏阴性发酵杆菌检索图

  3、对于已经确定了科、属的菌种，再进一步通过相应的检索表，找到其所在的种属。例如，待鉴定菌已经确定为肠杆菌科菌种，再参考“肠杆菌科属、种检索表（图3）”进一步通过苯丙氨酸脱羧酶试验、V-P试验、明胶液化实验、鸟氨酸脱羧酶试验等系列生化试验，根据试验结果，最终确定其种属。

图3  肠杆菌科属、种检索表（部分展示）

  上图中，可以清晰地确定出奇异变形菌、阪崎肠杆菌、普通变形菌等。

  4、也可通过“肠杆菌科内种间鉴别表”（图4），设置系列试验，根据结果判断待鉴定菌属于哪个种。

图4  肠杆菌科内种间鉴别表（部分展示）

四、简便方法

  对于常见细菌，也可以先通过革兰氏染色，确定其为革兰氏阴性菌还是革兰氏阳性菌，对于已经确定的革兰氏阴性细菌，可以使用我公司快检产品——博检系统，直接确认其所在的种属。有关博检系统详情和使用方法等可参考：博检革兰氏阴性细菌鉴定系统。

五、参考文献

  东秀珠,蔡妙英.《常见细菌系统鉴定手册》（1999）。

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