化妆品微生物标准检验方法金黄色葡萄球菌及注解
中华人民共和国国家标准
化妆品微生物标准检验方法金黄色葡萄球菌 UDC 668：576 .85.07
(GB7918.5－87)
Standard methods of microbiological examination for cosmetics
Staphylococcus aureus
金黄色葡萄球菌在外界分布较广，抵抗力也较强能引起人体局部化脓性病灶，严重时可导致败血症，因此化妆品中检验金黄色葡萄球菌有重要意义。
1 方法提要
根据本菌特有的形态及培养物质性，应用Baird Parker平板进行分离，该平板中的氯化锂可抑制革兰氏阴性细菌生长，丙酮酸钠可刺激金黄色葡萄球菌生长，以提高检出率，并利用分解甘露醇和血浆凝固酶等特征，以兹鉴别。
2 培养基和试剂
2.1 培养基
2.1.1 SCDLP液体培养基
见GB 7918.1 - 87《化妆品微生物标准检验方法 总则》。
2.1.2 7.5％的氯化钠肉汤
成分：蛋白胨          10g
牛肉膏                 3g
氯化钠                 75g
蒸馏水               1000ml
制法：将上述成分加热溶解，调pH为7.4，分装，121℃(15 1b)15min高压灭菌。
2.1.3 Baerd Parker 平板
成分： 胰蛋白胨           10g
牛肉膏                     5g
酵母浸膏                   1g
丙酮酸钠                  10g
甘氨酸                    12g
氯化锂(LiCl·6H2O)          5g
琼脂                      20g
蒸馏水                  950ml
                       pH7.0±0.2
增菌剂的配制：30％卵黄盐水50ml与除菌过滤的1％亚碲酸钾溶液10ml&127;混合，保存于冰箱内。
制法：将各成分到蒸馏水中，加热煮沸完全溶解，冷至25℃校正pH。分装每瓶95ml，121℃高压灭菌15min。临用时加热溶化琼脂，每95ml加入预热到50℃的卵黄亚碲酸钾增菌剂5ml，摇匀后倾注平板。培养基应是致密不透明的。使用前在冰箱储存不得超过48h。
2.1.4 血琼脂培养基
成分：营养琼脂                   100ml
脱纤维羊血(或兔血)                10ml
制法：将营养琼脂加热溶化，待冷至50℃左右以无菌手续加入脱纤维羊血，摇匀，制成平板，置冰箱内备用。
2.1.5 甘露醇发酵培养基
成分： 蛋白胨                   10g
氯化钠                           5g
甘露醇                          10g
牛肉膏                           5g
0.2％溴麝香草酚蓝溶液         12ml
蒸馏水                       1000ml
制法： 将蛋白胨、氯化钠、牛肉膏加到蒸馏水中，加热溶解，调pH7.4，加入甘露醇和指示剂，混匀后分装试管中，115℃(10 1b)20min灭菌备用。
2.1.6 兔(人)血浆制备
取3.8％柠檬酸钠溶液〔121℃(15 1b)30min灭菌〕1份加兔(人)全血4份，混匀静置，2000～3000r/min离心3～5min。血球下沉，取上面血浆。
3 设备和材料
3.1 显微镜。
3.2 培养箱。
3.3 离心要。
3.4 灭菌吸管：1ml，5ml，10ml。
3.5 灭菌试管。
3.6 载玻片。
3.7 酒精灯。
4 操作步骤
4.1 增菌：取1：10稀释的样品10ml接种到90mlSCDLP液体培养基中(如无此培养基也可用7.5％氯化钠肉汤)，置37℃培养箱， 培养24h。(1)
注：如无此培养基也可用7.5％氯化钠肉汤，检验含防腐剂的化妆品时，可在 1000ml此培养基中加1g卵磷脂、7g吐温80。
4.2 分离：自上述增菌培养液中，取1～2接种环，划线接种在Baird Parker氏培养基，如无此培养基也可划线接种到血琼脂平板，置37℃培养24～48。在血琼脂平板上菌落呈金黄色，大而突起，圆形，不透明，表面光滑，周围有溶血圈。在Baird Parker 氏培养基上为圆形，光滑，凸起，湿润，直径为2～3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明带。用接种针接触菌落似有奶油树胶的软度。偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落，但无混浊带及透明带。挑取单个菌落分纯在血琼脂平板上，置37℃培养24H。
4.3 染色镜检：挑取分纯菌落，涂片，进行革兰氏染色，镜检。金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌，排列成葡萄状，无芽胞，无夹膜，致病性葡萄球菌，菌体较小，直径约为0.5～1μm。
4.4 甘露醇发酵试验：取述分纯菌落接种到甘露醇发酵培养基中，置37℃培养24h，金黄色葡萄球菌应能发酵甘露醇产酸。
4.5 血浆凝固酶试验
4.5.1 玻片法：取清洁干燥载玻片，一端滴加一滴灭菌生理盐水，另一端滴加一滴血浆，用接种环挑取待检菌落，分别在生理盐水及血浆中充分研磨混合。血浆与菌苔混悬液在5min内出现团块或颗粒状凝块时，而盐水滴仍呈均匀混浊无凝固现象者为阳性，如两者均无凝固现象则为阴性。凡玻片试验呈阴性反应或盐水滴与血浆滴均有凝固现象，再进行试管凝固酶试验。
4.5.2 试管法：吸取1：4新鲜血浆0.5ml，放入灭菌小试管中，再加入待检菌24h肉汤培养物0.5ml。混匀，放37℃温箱或水浴中，每半小时观察一次，24h之内如呈现凝块即为阳性。同时以已知血浆凝固酶阳性和阴性菌株肉汤培养物及肉汤培养基各0.5ml 1：4血浆混匀，做为对照。
5 检验结果报告
凡在上述选择平板上有可疑菌落生长，经染色镜检，证明为革兰氏阳性葡萄球菌，并能发酵甘露醇产酸。血浆凝固酶试验阳性者，可报告被检样品检出金黄色葡萄球菌。
附加说明：
本标准由中国预防医学科学院环境卫生监测所归口。
本标准由“化妆品微生物标准检验方法”起草小组起草。
本标准主要起草人刘以贤。
本标准由中国预防医学科学院环境卫生监测所负责解释
注解:
（1）增菌培养
本标准方法用SCDLP增菌液增菌，其成分中含有中和剂，抑菌效果较差，杂菌生长较多。在增菌培养基中加适量的亚碲酸钾（钠），当金黄色葡萄球菌生长时可将其还原，变为黑色，使培养液增加碱性；亚碲酸钾（钠）并可与蛋白胨中含硫氨基酸结合，形成的亚碲酸与硫的复合物，有抗细菌硫源代谢作用，因而可抑制其他细菌生长繁殖。
（2）分离培养
分离金黄色葡萄球菌的培养基有（Vogel-Johnson琼脂、Baird Parker琼脂、血琼脂、卵黄高盐琼脂、TMP琼脂等、CTFA、FDA和日本的方法均用Vogel-Johson琼脂培养基。我国食品微生物标准检验方法规定Baird Parker琼脂和血琼脂培养基。Vogel-Johnson琼脂和Baird-Parker琼脂的基本成分类似。为尊重传统习惯用法，在化妆品标准检验方法中只选用Baird-Parker和血琼脂二种培养基。现将各分离鉴别培养基的主要成分，作用机制和注意事项介绍如下：
1） Baird-Parker和Vogel-Johnson琼脂培养基中的氯化钾可抑制革兰氏阴性菌生长，丙酮酸钠可刺激金黄色葡萄球菌生长，以提高检出率。
2）血琼脂不仅适应金黄色葡萄球菌的生长，菌落较大，颜色鲜明，而且有鉴别溶血反应的作用，可作为血凝固酶试验的补充，增加致病菌株的检出机会。
3）卵黄高盐琼脂、氯化钠用量较大，渗透压高，有抑制某些细菌的生长作用。卵黄中的卵磷脂，有促进金黄色葡萄球菌的生长发育和鉴别的作用。该菌的卵磷脂酶可分解卵磷脂，因而生长的典型菌落，表面周围有月晕状油膜，底部有乳浊圈，易于鉴别，本培养基抑菌作用较小，杂菌生长较多。
表4金葡萄球菌的菌落特征
培养基
 菌落特征
 
Baird-Parker琼脂
 圆形隆起，光滑，直径为2～3mm，呈灰色到黑色，边缘色淡，周围为一混浊带，外层有一透明带。
 
血琼脂
 金黄色，圆形隆起，边缘整齐，外周有透明的深血环，直径为1～2mm。
 
卵黄高盐
 金黄色，圆形隆起，边缘整齐，直径为1～2mm，外周有卵磷脂被分解的乳浊圈。
 
TMP琼脂
 金黄色，圆形隆起，边缘整齐，直径0.7～1mm,周围有黄色环。
 
4）TMP琼脂：加有适量亚碲酸钾，多量氯化钠以及甘露醇和酚红指示剂，抑制杂菌的作用较强，应适当加大接种量，取3～5环增菌液划线。金黄色葡萄球菌可还原亚碲酸钾使之变黑，并可发酵甘露醇产酸，使指示剂变黄，以致菌落呈墨黑色，周围有黄色环，容易鉴别。亚碲酸钾的用量应注意准确，因其抑菌力较强，对金黄色葡萄球菌的生长也有一定影响，因而菌落较小。
（3）糖发酵试验：多数葡萄球菌菌株分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、产酸不产气，致病性葡萄球菌在厌氧条件下分解甘露醇、产酸，非致病性葡萄球菌无此作用。
（4）血浆凝固酶试验
试管法是检测葡萄球菌的胞外游离血浆凝固酶（作用于凝固酶原）。
玻片法是检测结合血浆凝固酶（作用于纤维蛋白原）。此法快速、简便，大多数中间型葡萄球菌和猪葡萄球菌呈阴性反应。金黄色葡萄球菌中有10～15％可呈阴性反应。
有学者推荐乳胶凝集试验作为快速及常规检验方法。将1:8稀释的乳胶、悬液与等量人血浆（用EDTA处理后，经甘氨酸。盐酸缓冲液作1:1000稀释）混合制成乳胶制剂。试验时将待检菌置于加盐水的玻片上，再加一滴乳胶试剂，混匀观察结果，凝集则为血浆凝固酶阳性。本法的准确如同试管法。
（5）检验报告
1）按常规程序检验，凡分离出革兰氏阳性葡萄球菌的疑似菌落，经证实可发酵甘露醇、血浆凝固酶阳性的菌株，可报告检出金黄色葡萄球菌。
2）如果分离的疑似菌落不发酵甘露醇，但血浆凝固酶阳性也可断定为检出金黄色萄葡球菌。
3）分离出的葡萄球菌疑似菌落，不发酵甘露醇、血浆凝固醇阴性，判断未检出金黄色葡萄球菌。