支原体的生长、繁殖对培养基的要求比一般细菌高。除一般基础营养物质外，尚需要丰富的胆固醇、血清蛋白和酵母浸液，以提供支原体本身不能合成的营养物质。多数支原体生长最适宜的pH值为7.0-8.0，当pH6.5时支原体则停止生长，随即死亡。培养基应该用pH7.6-7.8。有些支原体分解糖类而产酸，有些支原体水解精氨酸或尿素而产碱。过酸、过碱对支原体的生长均不利。由于支原体的营养要求苛刻，许多培养基都要补充富含营养成分的添加剂如Eagle培养液。对分解葡萄糖、水解精氨酸和尿素的支原体，分别加入0.5%葡萄糖、0.2%精氨酸和0.05%尿素可促进这些支原体的生长和繁殖。多数支原体在一般大气环境中能生长、发育，但在初次分离的标本和固体培养基培养时，在含5%CO2及95%N2的气体环境中生长为宜，生长温度为36—37℃。多数支原体培养时pH7.6—8.0，分离人型支原体时pH应调到6.6，溶脲支原体为pH6.0。支原体适于生长在10—80%的湿度环境中，因而接种平板后宜用塑料袋包好，或胶布封闭，以保持湿度，液体或半固体培养时应盖硬胶塞或螺旋塞。