用特异荧光染料（Hoechst33258）染色后在荧光显微镜下进行检测。荧光染料（Hoechst33258）是一种能和DNA特异结合的物质。如果检测样品为支原体污染，则附在细胞表面的支原体DNA着色，在荧光显微镜下可见。 
1、仪器设备及制剂的配制 
（1）仪器荧光显微镜，CO2培养箱，细胞培养六孔板或其他容器。 
（2）培养基：DMEM完全培养基及无抗生素的DMEM培养基。
（3）试剂 
①二苯甲酰胺荧光染料（Hoechst33258）浓缩液：称取5mg二苯甲酰胺荧光染料，加入100ml不含碳酸氢钠的Hanks液中，室温下磁力搅拌30—40min，使其完全溶解，-2℃避光保存。 
②二苯甲酰胺荧光染料（Hoechst33258）工作液：量取100ml无酚红和碳酸氢钠的Hanks液，加入1ml二苯甲酰胺浓缩液混匀。 
③固定液：乙酸：甲醇（1：3）混合液。 
2、检查方法 
（1）取出：盖玻片培养细胞汇合前从瓶中取出：细胞最好处于70%汇合，如细胞完全汇合，能影响支原体的观察。 
（2）漂洗：将细胞盖片置于培养皿中，用不含酚红的Hanks液漂洗；细胞悬液则先离心去上清营养液后，再加入Hanks液漂洗。 
（3）固定：加入固定液5ml，放置10min。 
（4）漂洗：用生理盐水或去离子水漂洗，方法同（2）。 
（5）染色：加入二苯甲酰胺荧光染料工作液5ml，在室温下放置10min。 
（6）漂洗：吸出染液，用5ml水洗3次。  
（7）观察：取出盖玻片空气中干燥，细胞面向上，滴加pH5.5的磷酸缓冲液数滴，覆以盖玻片，在荧光显微镜下观察。 
3、结果判定 
   阳性结果：可见细胞周围或细胞膜上有大小不等、不规则荧光着色颗粒（绿色小点）。 
   当阴性结果和阳性结果均成立时，实验有效。如怀疑可疑，应重做。