吡利霉素检测方法

2010-3-19 14:40:33 青岛海博

1．分析目标化合物

吡利霉素（对于肝脏，吡利霉素和吡利霉素亚砜）

2．仪器设备

液相色谱—质谱仪。

3．试剂

    除下列试剂外，使用附录2所列试剂。
    盐酸吡利霉素一水合物标准品：含盐酸吡利霉素一水合物97%以上，熔点为210.5 ℃～ 212.5 ℃。
    二乙烯基苯－ N－乙烯基吡咯烷酮共聚物小柱（60 mg）：内径12～13mm 聚乙烯管中填充60mg二乙烯基苯－ N－乙烯基吡咯烷酮共聚物或具有同等分离特性的物质。

4．試验溶液的制备

1) 肌肉
①提取方法
    尽可能除去脂肪层，搅碎混合均匀后，称取其5.00g。加入100 mL甲醇：0.2%偏磷酸溶液(3：7)混合溶液，搅拌后，用涂布2～3 mm 厚硅藻土的滤纸抽滤于磨口减压浓缩器中。取出滤纸上的残留物，加入20mL甲醇：0.2%偏磷酸溶液(3：7)混合溶液，搅拌后，按上述同样操作，合并滤液于减压浓缩器中，40℃以下浓缩至约30mL。
②净化方法
    在二乙烯基苯－N－乙烯基吡咯烷酮共聚物小柱（60 mg）中，依次注入5mL甲醇和5mL水，舍弃流出液。柱中注入①提取方法所得的溶液后，注入5mL水，舍弃流出液。注入5mL甲醇，收集流出液于磨口减压浓缩器中，40℃以下除去甲醇。残留物中加入1.0mL乙腈：0.05%三氟乙酸（1：3）混合溶液溶解，此为试验溶液。
2)脂肪
①提取方法
    尽可能除去肌肉层，搅碎混合均匀后，称取其5.00g。加入30 mL正己烷和70 mL 0.2%的偏磷酸溶液，搅拌后，以每分钟3000转离心分离5分钟。收集0.2%偏磷酸层，用涂布2～3mm 厚硅藻土的滤纸抽滤于磨口减压浓缩器中。取出滤纸上的残留物，加入20mL甲醇：0.2%偏磷酸溶液(3：7)混合溶液，搅拌后，按上述同样操作，合并滤液于减压浓缩器中，40℃以下浓缩至约30mL。
②净化方法
    采用1）肌肉的②净化方法。
          3)肝脏，肾脏，奶及其它食用部分：
①提取方法
    肝脏：搅碎混合均匀后，称取其5.00g，在37 ℃下放置24小时。
    肾脏及其它食用部分：搅碎混合均匀后，称取其5.00g。
    奶：称取5.00g样品。
    加入100 mL甲醇：0.2%偏磷酸溶液(3：7)混合溶液，搅拌后，加入3g硅藻土混合，用涂布2～3 mm 厚硅藻土的滤纸抽滤于磨口减压浓缩器中。滤纸上的残留物中加入20mL甲醇：0.2%偏磷酸溶液(3：7)混合溶液，再搅拌后，按上述同样操作，合并滤液于减压浓缩器中，40℃以下浓缩至约30mL。
②净化方法
    采用1）肌肉的②净化方法。

5．标准曲线的制作

    将盐酸吡利霉素一水合物标准品配制成10 mg（以吡利霉素计）/100mL甲醇溶液，用乙腈：0.05%三氟乙酸混合溶液稀释，配制成在0.05 ～10 mg（以吡利霉素计）/L范围的溶液数点，分别注入LC/MS，用峰高法或面积法绘制成标准曲线。

6．定量试验

注入试验溶液于LC/MS中，根据5的标准曲线求出吡利霉素的含量。

7．测定条件

LC/MS
柱：十八烷基甲硅烷基化硅胶（粒径2 ～5 μm），内径2.0～6.0 mm、长100 ～250mm不锈钢管。
柱温：40 ℃
流动相：乙腈：0.05%三氟乙酸（1:3）混合溶液。
主离子(m/z)： ESI+ 411
保留时间标准：4～6 分钟

8．定量限

0.01 mg/kg。

9．注意事项

1)检测方法概述
肝脏样品，因代謝物吡利霉素亚砜要转变为吡利霉素，所以在37℃放置24 小时。
本方法用甲醇与0.2%偏磷酸溶液的混合溶液从样品中提取吡利霉素，经二乙烯基苯－ N－乙烯基吡咯烷酮共聚物小柱净化后，LC/MS测定和确证。
2) 注意点
① 对于LC/MS，标准溶液和试验溶液的标准进样量，内径3.0 mm 柱子为10 μL。因柱子和仪器设备使最佳进样量不同，必须研究最佳的进样量。
②采用主离子的仪器设备，因为最适合的离子化方法、生成的离子不同，要研究仪器设备最合适的条件。
对于主离子之外的确证离子，ESI+为363(m/z)。