在应用细胞和组织培养物来进行病毒繁殖或其他培养时，未经灭菌的房间空气通过工作台面是不符合要求的。Ⅱ级生物安全柜在设计上不但能提供个体防护，而且能保护工作台面的物品不受房间空气的污染。Ⅱ级生物安全柜有四种不同的类型（分别为A1、A2、B1和B2型），它们不同于Ⅰ级生物安全柜之处为，只让经HEPA过滤的（无菌的）空气流过工作台面。Ⅱ级生物安全柜可用于操作危险度2级和3级的感染性物质。在使用正压防护服的条件下，Ⅱ级生物安全柜也可用于操作危险度4级的感染性物质。