Ⅲ级生物安全柜用于操作危险度4级的微生物材料，可以提供最好的个体防护。Ⅲ级生物安全柜的所有接口都是“密封的”，其送风经HEPA过滤，排风则经过两个HEPA过滤器。Ⅲ级生物安全柜由一个外置的专门的排风系统来控制气流，使安全柜内部始终处于负压状态（大约124.5 Pa）。只有通过连接在安全柜上的结实的橡胶手套，手才能伸到工作台面。Ⅲ级生物安全柜应该配备一个可以灭菌的、装有HEPA过滤排风装置的传递箱。Ⅲ级生物安全柜可以与一个双开门的高压灭菌器相连接，并用它来清除进出安全柜的所有物品的污染。可以将几个手套箱连在一起以增大工作面积。Ⅲ级生物安全柜适用于三级和四级生物安全水平的实验室。