附录

附录1  已批准上市的微生态活菌制品

附录2  微生态活菌制品活菌数测定法

附录3  微生态活菌制品杂菌检查法

使用说明

应符合“生物制品包装规程”规定和批准的内容。

附录1  已批准上市的微生态活菌制品

 

 

附录2  微生态活菌制品活菌数测定法

       无菌称取3.0g制品或菌粉（胶囊取内容物），加入27.0ml稀释液中，充分摇匀，做10倍系列稀释（最终根据不同的指标要求而定）。取最终稀释度的菌液100μl，滴入选择性琼脂培养基平皿上，共做3个平皿，并以玻棒涂布均匀，置适宜条件下培养，到期观察每个平皿菌落生长情况，并计数。当平皿菌落数小于10或大于300时，应调整最终稀释度，重新测定。根据3个平皿菌落数按下列公式计算活菌数：

 

活菌数（CFU/g）=   3个平皿菌落数之和／3 ×10×最终稀释度

                        

       【附注】（1）活菌数用“CFU”表示，即为细菌集落单位。

       （2）稀释液使用灭菌生理氯化钠溶液或其他适宜的稀释液。

       （3）选择性琼脂培养基，是指最适宜制剂（或菌粉）中活菌生长的培养基。须经批准后方可使用。

 

附录3   微生态活菌制品杂菌检查法

      微生态活菌制品杂菌检查法系检查微生态活菌制品的菌粉、半成品及成品受外源微生物污染程度的方法。检查项目包括控制菌检查，非致病性杂菌、真菌计数。

       杂菌检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。

      除另有规定外，本检查法中细菌培养温度为30～37℃；真菌培养温度为20～28℃。

      检验量及供试品的准备

      检验量，即一次试验所用的供试品量（g）。检验时，应从2个以上最小包装单位中随机抽取不少于3倍检验用量的供试品。

      菌粉、半成品以及成品为散剂和颗粒剂的可直接称取备用；成品为片剂、胶囊剂的需研碎后备用。

      控制菌检查

      控制菌检查用培养基的适用性检查

      控制菌检查用的培养基，即成品培养基、由脱水培养基或按培养基处方配制的培养基，均应进行培养基的适用性检查。检查项目包括促生长、指示和抑制特性能力。

      菌种  试验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。

      大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B)44102]

      金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B)26003]

      乙型副伤寒沙门菌（Salmonella paratyphi B）[CMCC(B)50094]

      铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC(B)10104]

      生孢梭菌（Clostridium sporogenes）[CMCC(B)64941]

      白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F)98001]

      痢疾志贺菌（Shigella dysenteriae）[CMCC(B)51252]

      菌液制备  接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，培养18～24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，培养24～48小时。用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10～100CFU或100～1000CFU的菌悬液。

       菌悬液制备后应在2小时内使用，若保存在2～8℃的菌悬液可以在24小时内使用。

 

      适用性检查   控制菌检查用培养基的适用性检查所用的菌株及检验项目见表1。

 

表1  控制菌检验用培养基的促生长、抑制和指标能力检查

 

       （1）增菌培养基促生长能力检查  分别接种不超过100CFU的试验菌于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。与对照培养基比较，被检培养基试验菌应生长良好。

       （2）固体培养基促生长能力检查  取试验菌各0.1ml（含菌数50～100CFU）分别涂布于被检培养基和对照培养基平皿中，每种培养基平行制备2个平皿，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。被检培养基与对照培养基相比，生长的菌落大小、形态特征应一致。

       （3）培养基抑制能力检查   接种不小于100CFU的试验菌于被检培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最长时间下培养，试验菌应不得生长。

       （4）培养基指示能力检查   分别接种不超过100CFU的试验菌于被检培养基和对照培养基平皿上，在相应控制菌检查规定的培养温度及时间下培养。被检培养基中试验菌生长的菌落形态、大小、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。

       

        供试品检查

        供试品的控制菌检查应按下述方法进行。

        阳性对照试验  供试品进行控制菌检查时，应做阳性对照试验。取阳性对照菌于相应选择培养基平皿上划线接种，按供试品的控制菌检查方法培养，观察菌落生长情况。阳性对照试验应检出相应的控制菌。

       阴性对照试验   取增菌液0.1ml，照相应控制菌检查法检查，作为阴性对照。阴性对照应无菌生长。

      1.    大肠埃希菌（Escherichia coli）

      （1）增菌培养  称取供试品1g，加到9ml灭菌胆盐乳糖培养基中，培养18～24小时。

      （2）特异培养  将上述增菌液摇匀，取0.1ml滴加到曙红亚甲蓝琼脂平皿上，以玻棒涂匀，一式3份，培养18～24小时，观察菌落生长情况。

      （3）结果判定  阳性对照平皿应长出紫黑色、圆形、稍凸起、边缘整齐、表面光滑、带有金属光泽的菌落。

供试品平皿上若未见菌落生长或生长的菌落与阳性对照的菌落形态特征不符，判供试品未检出大肠埃希菌；若生长的菌落与阳性对照的菌落形态特征相符货疑似，应做革兰氏染色镜检等适宜的鉴定试验，鉴别是否为制品中的目的菌或大肠埃希菌。

       2.志贺菌（Shigella）、沙门菌（Salmonella）

      （1）增菌培养  称取供试品1g，加到9ml灭菌胆盐乳糖培养基中，培养18～24小时。

      （2）特异培养  将上述增菌液摇匀，取0.1ml滴加到沙门、志贺菌属琼脂平皿上，以玻棒涂匀，一式3份，培养24～48小时，观察菌落生长情况。

      （3）结果判定  阳性沙门菌对照平皿应长出无色透明或半透明、圆形、光滑、稍隆起菌落，中心呈黑褐色。阳性志贺菌对照平皿应长出无色、半透明、圆形、微凸、光滑的菌落。

      供试品平皿培养24小时、48小时各观察结果1次，若未见菌落生长，判供试品未检出、沙门菌；若有菌落生长，应与阳性对照的菌落比较，并做革兰氏染色镜检等适宜的鉴定试验，鉴别是否为制品中的目的菌或志贺菌、沙门菌。

        3.铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）

      （1）增菌培养  称取供试品1g，加到9ml的NAC液体培养基中，培养18～24小时。

      （2）特异培养  将上述增菌液摇匀，取0.1ml滴加NAC琼脂平皿上，以玻棒涂匀，一式3份，培养24～48小时，观察菌落生长情况。

      （3）结果判定  阳性对照平皿应长出产绿色色素的菌落，可使整个培养基呈绿色。

      如平皿上无菌落生长或生长的菌落与阳性对照菌落形态特征不符，判供试品未检出铜绿假单胞菌；如平皿生长的菌落与上述菌落形态特征相符或疑似，应挑选2～3个菌落，分别接种于营养琼脂培养基斜面上，培养18～24小时。取斜面培养物进行革兰氏染色、镜检及氧化酶试验，鉴别是否为制品中的目的菌或铜绿假单胞菌。

        氧化酶试验  取洁净滤纸片置于平皿内，用无菌玻棒取斜面培养物涂于滤纸片上，滴加新配制的1%二盐酸二甲基对苯二胺试液，在30秒内若培养物呈粉红色并逐渐变为紫红色为氧化酶试验阳性，否则为阴性。

        若斜面培养物为非革兰氏阴性无芽孢杆菌或氧化酶试验阴性，均判供试品未检出铜绿假单胞菌。否则，应进行绿脓菌素试验。

       绿脓菌素（Pyocyanin）试验  取斜面培养物接种于PDP琼脂培养基斜面上，培养24小时，加三氯甲烷3～5ml只培养管中，搅碎培养基并充分振摇。静置片刻，将三氯甲烷相移至另一试管中，加入1mol/L盐酸试液约1ml，振摇后，静置片刻，观察。若盐酸溶液呈粉红色，为绿脓菌素试验阳性，否则为阴性。同时用未接种的PDP琼脂培养基斜面同法作阴性对照，阴性对照试验应呈阴性。

       若上述疑似菌为革兰氏阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿脓菌素试验阳性，判供试品检出铜绿假单胞菌；若上述疑似菌为革兰氏阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿脓菌素试验阴性，应继续进行适宜的鉴定试验，确认是否为铜绿假单胞菌。

       4.金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）

      （1）增菌培养  称取供试品1g，加到9ml7.5%灭菌氯化钠肉汤培养基中，培养18～24小时。

      （2）特异培养  将上述增菌液摇匀，取0.1ml滴加到甘露醇氯化钠琼脂平皿上，以玻棒涂匀，一式3份，培养24～48小时，观察菌落生长情况。

      （3）结果判定  阳性对照平皿应长出产金黄色素的圆形、凸起、边缘整齐的菌落。

       供试品平皿上若未见菌落生长或生长的菌落与阳性对照菌落形态不符，判未检出金黄色葡萄球菌；若平皿上生长的菌落与阳性对照品的菌落特征相符或疑似，应挑选2～3个菌落，分别接种于营养琼脂培养基斜面上，培养18～24小时。取营养琼脂培养基的培养物进行革兰氏染色，并接种于营养肉汤培养基中，培养18～24小时，做血浆凝固酶试验。

      血浆凝固酶试验  取灭菌小试管3支，各加入血浆和无菌水混合液（体积比1:1）0.5ml，再分别加入可以菌株的营养肉汤培养物（或由营养琼脂培养基斜面培养物制备的浓菌悬液）0.5ml、金黄色葡萄球菌营养肉汤培养物（或营养琼脂培养基斜面培养物制备的浓菌悬液）0.5ml.、营养肉汤或0.9%无菌氯化钠溶液0.5ml，即为试验管、阳性对照管和阴性对照管。将3管同时培养，3小时后开始观察直至24小时。阴性对照管的血浆应流动自如，阳性对照管血浆应凝固，若试验管血浆凝固者为血浆凝固酶试验阳性，否则为阴性。如阳性对照管或阴性对照管不符合规定时，应另行制备血浆，重新试验。

       若上述疑似菌为非革兰氏阳性球菌、血浆凝固酶试验阴性，亦非制品中的目的菌，判供试品未检出金黄色葡萄球菌。

       5.梭菌（Clostridium）

       （1）增菌培养  取供试品1g，2份，其中1份置80℃保温10分钟后迅速冷却。上述2份供试品直接或处理后分别接种至9ml的梭菌增菌培养基中，置厌氧条件下培养48小时。

       （2）特异培养  取上述每一培养物0.1ml，分别涂布接种于含庆大霉素的哥伦比亚琼脂培养基平皿上，一式3份，置厌氧条件下培养48～72小时。

      （3）结果判定  阳性对照平皿应长出典型的梭菌菌落。若供试品平皿上未见菌落生长，判供试品未检出梭菌；若供试品平皿上有菌落生长，应挑选2～3个菌落分别进行革兰氏染色和过氧化氢酶试验。

      过氧化氢酶试验  取上述平皿上的菌落，置洁净玻片上，滴加3%过氧化氢试液，若菌落表面有气泡产生，为过氧化氢酶试验阳性，否则为阴性。

若上述可以菌落为革兰氏阳性菌落，应对芽孢的位置、大小、形态进行观察，并做适宜的鉴定试验，判断是否为梭菌。

       6.白色念珠菌（Candida albicans）

      （1）增菌培养  取供试品1g，接种至9ml的沙氏葡萄糖肉汤培养基中，培养24～48小时。

      （2）特异培养  取上述培养物0.1ml，滴加到沙氏葡萄糖琼脂培养基平皿上，以玻棒涂匀，一式3份，培养24～48小时（必要时延长至72小时）。

      （3）结果判定  阳性对照平皿应长出乳白色偶见淡黄色的菌落，菌落表面光滑，有浓酵母气味，培养时间稍久则菌落增大、颜色变深、质地变硬或有褶皱。若供试品平皿上未见菌落生长或生长的菌落与阳性对照菌落形态特征不符，判供试品未检出白色念珠菌。如供试品平皿上生长的菌落与阳性对照菌落形态特征相符货疑似，应挑选2～3个菌落分别接种至念珠菌显色培养基平皿上，培养24～48小时（必要时延长至72小时）。若供试品平皿上无绿色或翠绿色的菌落生长，判供试品未检出白色念珠菌。若供试品平皿上生长的菌落为绿色或翠绿色，挑取相符或疑似的菌落接种于1%聚山梨酯80-玉米琼脂培养基上，培养24～48小时。取培养物进行革兰氏染色镜检及芽管试验。

       芽管试验  挑取1%聚山梨酯80-玉米琼脂培养基上的培养物，接种于加有1滴血清的载玻片上，盖上盖玻片，置湿润的平皿内，于35～37℃放置1～3小时，显微镜下观察，可见到由孢子长出短小芽管。

       若上述疑似菌为非革兰氏阳性菌，显微镜未见厚膜孢子、假菌丝、芽管，亦非制品中的目的菌，判供试品未检出白色念珠菌。

 

       非致病性杂菌、真菌计数

       1.计数培养基的适用性检查

      费致病性杂菌、真菌计数用的培养基，及成品培养基、由脱水培养基或按培养基处方配制的培养基，均应进行培养基的适用性检查。

       菌种  对试验菌种的要求同控制菌培养基的适用性检查。枯草芽孢杆菌活菌制品不应选择枯草芽孢杆菌作为试验菌株。

       大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]

       金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]

       枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]

       白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]

      菌液制备  接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，培养18～24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，培养24～48小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100CFU或500～1000CFU的菌悬液。

       菌悬液制备后应在2小时内使用，若保存在2～8℃的菌悬液可在24小时内使用。

       适用性检查  取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌菌液各1ml（含50～100CFU），分别注入无菌平皿中，立即倾注营养琼脂培养基。每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置30～37℃培养48小时，计数；取白色念珠菌液1ml（含50～100CFU），注入无菌平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置20～28℃培养72小时，计数。或采用涂布法，取上述菌液各0.1ml（含菌数50～100CFU），分别涂布于相应琼脂培养基平皿上，以玻棒涂布均匀，一式2份，同法培养，计数。同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。

       结果判定  被检培养基的菌落平均数与对照培养基的菌落平均数相比大于70%，且菌落形态、大小应与对照培养基上的菌落一致，判该培养基的适用性检查符合规定。

       2.    供试品检查

       供试品的非致病性杂菌、真菌检查应按下述方法进行。

      阳性对照  除另有规定外，真菌以白色念珠菌为对照，其它以金黄色葡萄球菌为对照菌。

      因供试品为活菌制品，应选用能抑制目的菌生长的选择性培养基进行检查。除另有规定外，营养琼脂培养基用于非致病性杂菌的计数，玫瑰红钠琼脂培养基用于真菌计数。

      （1）真菌计数  称取供试品1g，加到9ml0.9%无菌氯化钠溶液或其他适宜稀释液中，混匀，做10倍系列稀释，取适宜稀释度供试品溶液0.1ml加到已备好的玫瑰红钠琼脂培养基上，以玻棒涂匀，一式3份，倒置，于恒温培养箱中培养96小时，每天观察结果，记录平皿上生长的真菌菌落数。

      结果计算：以3个平皿上生长的菌落平均数计算。

 

       真菌数（CFU/g）=  3个平皿菌落数之和／3 ×100

                                     

       （2）非致病性杂菌计数   称取供试品1g，加到9ml0.9%无菌氯化钠溶液或其他适宜稀释液中，混匀，做10倍系列稀释，取适宜稀释度供试品溶液0.1ml加到已备好的琼脂培养基上，以玻棒涂匀，一式3份，倒置，恒温培养箱中培养48小时，每天观察结果，记录平皿上生长的菌落数。

        结果计算：方法同真菌计数。

     

       结果判定

       供试品检查控制菌或其他致病菌时，按一次检出结果为准，不再复试。

       供试品的非致病菌杂菌总数、真菌数，任何一项不符合规定，不再复试。

       控制菌检查、非致病性杂菌总数、真菌数3项结果均符合规定，判供试品杂菌检查合格；若其中任何一项不符合规定，判供试品杂菌检查不合格。

 

       稀释液

       除另有规定外，微生态活菌制品杂菌检查用稀释液采用0.9%无菌氯化钠溶液。稀释液配制后，应采用验证合格的灭菌程序灭菌。

       1.pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液

        照无菌检查法（附录XII A）制备。

        2.0.9%无菌氯化钠溶液

       称取氯化钠9.0g，加水溶解使成1000ml，过滤，分装，灭菌。

     

       培养基及其制备方法

       照无菌检查法（附录XII A）和微生物限度检查法（附录XII G）中“培养基及其制备方法”的处方制备，未收录的培养基可按照以下配方配制，也可使用按该处方生产的符合要求的脱水培养基。配制后，应采用验证合格的灭菌程序灭菌。

      1.7.5%氯化钠肉汤培养

        蛋白胨         10.0g

        氯化钠         75.0g

        牛肉浸粉        3.0g

        水            1000ml

       取上述成分混合，微温溶解，调pH值为弱碱性，煮沸，滤清，调pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，灭菌。

 

      2.NAC液体培养基

      蛋白胨                    20.0g

      萘啶酮酸               0.015g

      硫酸镁                      0.3g

      磷酸氢二钾                0.3g

      溴化十六烷基三甲铵    0.3g

      水                       1000ml

      取上述成分，混合，微温溶解，调pH值使灭菌后为7.5±0.1，分装，灭菌。

 

      3.NAC琼脂培养基

      蛋白胨                     20.0g

      萘啶酮酸                0.015g

      硫酸镁                       0.3g

      磷酸氢二钾                 0.3g

      琼脂                        14.0g

      溴化十六烷基三甲铵     0.3g

      水                         1000ml

      除琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调pH值使灭菌后为7.5±0.1，加入琼脂，加热溶胀后，分装，灭菌，冷至60℃，倾注平皿。

      限度标准

     杂菌检查的限度标准是基于药品的给药途径和对患者健康潜在的危害以及活菌制品的特殊性而制订的。

 

        1.口服微生态活菌制品

       （1）菌粉

      大肠埃希菌  每1g不得检出。

      金黄色葡萄球菌  每1g不得检出。

      铜绿假单胞菌  每1g不得检出。

      沙门菌及志贺菌  每1g不得检出。

      非致病性杂菌数  每1g不超过500CFU。

      真菌数  每1g不超过100CFU。

      （2）半成品、成品

      大肠埃希菌  每1g不得检出。

      金黄色葡萄球菌  每1g不得检出。

      铜绿假单胞菌  每1g不得检出。

      沙门菌及志贺菌  每1g不得检出。

      非致病性杂菌数  每1g不超过1000CFU。

      真菌数  每1g不超过100CFU。

     2.阴道微生态活菌制品

     菌粉、半成品及成品：

     金黄色葡萄球菌  每1g不得检出。

     铜绿假单胞菌  每1g不得检出。

     梭菌  每1g不得检出。

     白色念珠菌  每1g不得检出。

     真菌  每1g不得检出。

     非致病性杂菌数  每1g不超过100CFU。