微生物法测定青霉素残留量的研究

2010-10-26 13:38:23 周口新闻网

【摘要】 目的建立测定青霉素残留量的微生物法。方法利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，采用管碟法对培养温度、青霉素的最低检测限及试验用菌种ATCC941a对硫酸链霉素的最大耐受量等条件进行研究。结果培养温度确定为28℃，青霉素的最低检测限为0.008u/mg，试验用菌种ATCC941a对硫酸链霉素的最大耐受量为60mg/ml。结论该方法灵敏度高，可用于青霉素残留量的测定。

【关键词】 管碟法；青霉素残留量；含量测定

　　Penicillin residue assay by microbiological method
　　ABSTRACT Objective To establish a microbiological method for penicillin residue assay. Methods The parameters including culture temperature, limit of detection (LOD) of penicillin and the maximum tolerance dose of experimental strain ATCC9341a to streptomycin sulfate were detected by cylinderplate method. Results The culture temperature was 28℃ and the LOD of penicillin was 0.008 u/ml, and the maximum tolerance dose of experimental strain ATCC9341a to streptomycin sulfate was 60 mg/ml. Conclusion This method was sensitive and can be used for penicillin residue assay.

　　KEY WORDS Cylinderplate method; Penicillin residue; Assay

　　青霉素类药物仍是目前常用的抗菌药，但其过敏反应一直危害着患者的身体健康。美国联邦法规中指出，若有相互污染的可能性，非青霉素药品应化验是否含有微量青霉素；若能测出有微量青霉素存在，则本批药品不可出售。本文以青霉素标准品，就微生物法测定青霉素残留量的各影响因素进行了研究探讨，建立了测定青霉素残留量的微生物法。该方法灵敏度高，可用于青霉素残留量的测定。

　　1 试剂与材料

　　1.1 试剂

　　ChPⅡ培养基，USPⅠ培养基，1% pH6.0磷酸盐缓冲液，1000u/ml青霉素酶溶液，藤黄八叠球菌ATCC9341a，0.9%的氯化钠溶液，青霉素标准品。

　　1.2 仪器与用具

　　生化培养箱(15～40℃)，超净工作台，钢管，钢管放置器，培养皿。

　　2 试验方法

　　2.1 菌液的制备

　　将工作用菌种ATCC9341a的斜面培养物，接种于USPⅠ号培养基斜面，32～35℃培养24h，用0.9%的氯化钠溶液洗涤，用前用0.04u/ml的青霉素标准液标定，每100ml培养基中加菌量所致抑菌圈直径15～18mm为宜。

　　2.2 双碟平板的制备

　　向已熔化并放置40～50℃的培养基中加入适量ATCC9341a菌液，摇匀。取菌液10ml，加入已灭菌的双碟中，待培养基凝固后，于每个双碟中放入4枚小钢管。

　　2.3 培养基及培养温度的选择

　　精密称取青霉素标准品15～20mg，用1% pH6.0磷酸盐缓冲液稀释至0.04u/ml的标准溶液，分别用ChPⅡ培养基，USPⅠ培养基制备双碟平板，滴碟后室温放置1～2h，分别于28和37℃恒温培养16～18h，测定抑菌圈直径。

　　2.4 培养温度对青霉素最低检测限的影响

　　精密称取青霉素标准品15～20mg，用1% pH6.0磷酸盐缓冲液稀释为0.015、0.01、0.08和0.007u/ml。用“2.3”中选出的最佳培养基(ChPⅡ)制备双碟平板，每个浓度至少滴加10个钢管，滴碟后室温放置1～2h，分别于28和37℃恒温培养16～18h，测定抑菌圈直径，计算平均值。

　　2.5 试验用菌种ATCC941a对硫酸链霉素的最大耐受量等条件进行研究

　　精密称取硫酸链霉素250、300和350mg分别加入4ml 1% pH6.0磷酸盐缓冲液和1ml青霉素酶溶液(1000u/ml)，使成为70、60和50mg/ml的硫酸链霉素溶液，用ChPⅡ培养基制备双碟平板，滴碟后室温放置1～2h，分别于28和37℃恒温培养16～18h，测定抑菌圈直径，计算平均值。

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　　2.6 样品中青霉素最低检测限的确定

　　精密称取硫酸链霉素样品适量，用1% pH6.0的磷酸盐缓冲液稀释，加入1u/ml青霉素标准溶液使成为下列几种浓度的溶液：

　　溶液A：含50mg/ml硫酸链霉素并含0.015u/ml青霉素；

　　溶液B：含50mg/ml硫酸链霉素并含0.005u/ml青霉素；

　　溶液C：含50mg/ml硫酸链霉素并含0.004u/ml青霉素。

　　用ChPⅡ培养基制备双碟平板，滴碟后室温放置1～2h，分别于28和37℃恒温培养16～18h，测定抑菌圈直径,计算平均值。

结果

　　3.1 培养基及培养温度试验

　　结果见表1。

　　3.2 培养温度与青霉素最低检测限关系

　　结果见表2。

　　3.3 试验用菌种ATCC941a对硫酸链霉素的最大耐受量

　　测试结果见表3。

　　3.4 样品中青霉素最低检测限的确定

　　结果见表4。

　　4 结论与讨论

　　(1)ChPⅡ培养基与USPⅠ培养基均可使用，但培养温度在28℃比37℃扩散效果好。

　　(2)青霉素的最低检测限在28℃下为0.008u/ml，在37℃下为0.015u/ml，FDA资料显示在26～30℃培养，最低检测限为0.01u/ml。检验过程中适当

　　表1        培养基及培养温度的试验结果　略

　　表2    培养温度及青霉素最低检测限的研究结果　略

　　表3    试验用菌种ATCC941a对硫酸链霉素的最大耐受量的测试结果　略

　　表4      样品中青霉素最低检测限的确定结果　略

　　(3)FDA资料中给出的ATCC941a对硫酸链霉素的最大耐受量为50mg/ml，本文给出ATCC941a对硫酸链霉素的最大耐受量为60mg/ml。

　　(4)结果表明此方法灵敏度高，可用于测定青霉素残留量。

【参考文献】
　　［1］ FDA bylines VoL.8,No.3,Nov.1977

　　［2］ CFR Penicillin activity. 1976，436.104

　　［3］国家药典委员会. 中华人民共和国药典［S］. 北京：化学工业出版社，2005：附录Ⅵ

　　［4］ United state pharmacopeial Covention,Inc. The United states pharmacopeia USP 27.NF22 ［S］. Rockville,MD: United states pharmacopeia,2004:2163