微生物限度检查中的菌数计数属于定量实验。验证试验是通过对加入的各种规定微生物的回收率试验来进行的。验证中可以仅选用在How3 已确定的敏感菌作试验，这样可减少工作量，因为能满足敏感菌生长的条件必然能满足其他菌的生长。也可以完全按药典规定，逐一进行每种试验菌的验证：对每种试验菌均应建立 （1）试验组（供试液加菌液组）——菌数计数测得CFU1 、（2）菌液组 ——菌数计数测得CFU2 、（3）供试液本身对照组 ——菌数计数测得CFU3 、（4）稀释剂对照组 ——菌数计数测得CFU4 。 验证试验和对验证结果技术评价的判断为：应符合 CFU4 ÷ CFU2 ≥70 ％（CFU 1 －CFU3 ）÷ CFU2 ≥70 ％

如两个回收率均≥70 ％，则说明所用方法已消除了供试品的抑菌活性。可以确定按该方法进行该品种的菌数计数检查；如回收率小于70 ％，则说明仍有抑菌活性，应考虑进一步采取适宜的措施以消除抑菌活性，并重新验证，直至验证结果回收率均≥70 ％证明已充分消除或有效降低抑菌活性为止。

微生物限度检查中的控制菌检查属于定性试验。在验证试验中，应同时设置：（1）目标菌阳性对照管、（2）供试品＋目标菌管、（3）阴性对照管、（4）非目标菌对照管。验证试验和对验证结果技术评价的判断为：

（1）目标菌阳性对照管菌必须生长良好、（2）供试品＋目标菌管生长良好、（3）阴性对照管必须无菌生长、（4）阴性菌对照必须无菌生长” 则说明试验成立，并且所用方法已消除或充分减低了供试品的抑菌活性。可以确定按该方法进行该品种的控制菌检查；如出现“（2）供试品＋目标菌管生长缓慢、或不生长”则说明仍有抑菌活性，应考虑进一步采取适宜的措施以消除抑菌活性，并重新验证，直至验证结果中（2）供试品＋目标菌管与（1）目标菌阳性对照管相同，证明已充分消除或有效降低抑菌活性为止。

如出现“（3）阴性对照管有菌生长、（4）阴性菌对照管有菌生长”则说明实验不成立，所用方法不专属。应寻找原因并重新验证试验。

通过以上4 个步骤的验证试验实践，综合分析实验中遇到的所有情况和所采取的方法，原始、真实地记录下来形成一份详细的、具有可操作性和重现性的验证报告。并在产品的质量标准中【无菌】或【微生物限度】项下明确经验证试验确定的检验操作方法：明确样品前处理方法、步骤，判断有无抑菌活性的依据，消除抑菌活性采用的具体方法，以及各方法操作的关键点等。

四、什么时候验证 (when)

（1）当建立药品的微生物学检查方法时。——即当申报新药时必须附有进行微生物学检查的方法学验证的资料。并在药品质量标准的【无菌】或【微生物限度】项下明确经验证试验4确定的检验操作方法。

（2 ）产品的组分或原检验条件发生改变时。——考察这些改变对微生物生长的影响。

（3 ）定期再验证 ——考察验证结果的稳定性和及时发现影响微生物生长的因素。

（4 ）可与产品的微生物学检查同时进行。

五．方法学验证结果和验证报告的技术评价

1 、药检所审核企业提交的验证材料时如何审核？——通过所报敏感菌来验证结果的可靠性。

2 、新药注册审评时如何评价验证材料？

（1）首先按给药途径确定被审品种应符合无菌检验还是微生限度检查，确定验证项目。

（2）如应做微生物限度检查，确定该品种规定的微生物限度标准，再确定应验证哪些项目。

（3）根据上述开展验证的思路和程序进行审核。

（4）一份技术含量高的验证材料和验证结果应能很好地回答出上文所指出的4 个W 。特别是其中的what 和how 的内容：

样品的前处理方法的合理性，及方法不影响微生物生长的证明；

有判断供试品有抑菌性、抑什么菌的依据、资料、实验记录证明；

如证明有抑菌性，最敏感菌是那个？

审核所选消除抑菌性的方法，及其合理性、有效性的证明。

检查经验证所确定的检验方法和条件是否能满足最敏感菌的要求？等方面。

（5 ）关注中检所验证实验信息交流平台WWW.antibiotic.cn ，了解当前的一些新动向。如：乳膏类制剂的前处理用Bacl2 溶液作破乳剂、用Mnso4 作为喹诺酮类药品的中和剂、和其他有效中和剂的开发使用信息等新方法的合理性和有效性考察资料。提高对验证进行技术评价的能力。

3 、一份标准的技术性验证报告应由以下部分组成：

一、实验目的

二、样品信息

三、验证方案（初步验证方案、重新验证方案，纠正原因）和方案的批准。

四、仪器与实验材料(培养基、菌种、仪器、设备)

五、方法验证(方法依据、供试菌液制备、菌液计数、敏感菌选择、所用方法考察、方法验证步骤、实验原始记录)。

六、验证结论。

七、【检查】项下【无菌】或【微生物限度】 具体方法确定。

八、实验员签名、验证报告批准人签名。

4 、用语规范。

注[1 ] 要求执行验证的相关法规和文件

为了确保开展微生物学检验方法的验证，国食监注〔2005 〕234 号“关于颁布和执行《中国药典》2005 年版有关事宜的通知” 国药典发〔2005 〕98 号“关于执行《中国药典》2005年版微生物限度检查法和无菌检查法有关问题的说明”中检药〔2006 〕862 号“第七届全国药品检验所抗生素室主任工作会议暨全国药品微生物检验方法及标准研讨会会议纪要”都作了说明和规定。

[作者简介] 钱维清，女，主任药师，从事药品微生物检验及质量控制。