主要病原菌的认识（一）

目的要求

认识结核分枝杆菌、布氏杆菌、炭疽杆菌、猪丹毒杆菌和多杀性巴氏杆菌的形态染色特性和培养特性。

操作步骤

一、结核分枝杆菌

取培养物抹片（如没有培养物可用卡介苗代替）、干燥、火焰固定，用齐一尼氏法作抗酸染色（方法见实验二），干后镜检观察。

（一）形态染色特性  本菌为革兰氏阳性细长或微弯杆菌，牛型比人型短而粗，禽型具多形性。无芽胞、无荚膜，不能运动，用齐一尼氏法作抗酸染色，镜检，红色细菌为抗酸菌，其他细菌为兰色。

（二）培养特性  本菌营养要求高，生长缓慢，需2～6周才能发育好，在甘油琼脂上形成干燥颗粒状，乳白色不透明叠起的菌落。

二、布氏杆菌

布氏杆菌的病料最好取新鲜流产胎儿的胃内容物，或用羊水、胎盘的坏死部分，阴道分泌物等，必要时也可取乳汁和尿进行检验。但乳汁和尿因含水较多，最好先用离心法沉淀，取其沉淀物进行镜检，分离培养或接种豚鼠。

取上述病料涂片（如无病料可用布氏抗原代替），用鉴别染色法着染后再进行镜检观察。

鉴别染色法常用以下两种：

（二）科兹洛夫斯基法  具体方法依次为：涂片、自然干燥、火焰固定，用2％沙黄（即番红花红）水溶液加温染色，出现气泡为止（约1.5分钟），充分水洗1～2分钟，再用1％孔雀绿水溶液染色0.5～1分钟（亦可用美兰液代替孔雀绿），水洗、干燥、镜检。

本菌呈红色，其他菌呈绿色（最好40分钟内镜检，经久则红色褪去）。

（二）改良齐一尼氏法  具体方法依次为：涂片、干燥、火焰固定，用稀释石炭酸复红液染色10分钟，水洗，再用0.5％的醋酸处理，不超过30秒钟，充分水洗，用1％美兰轻度复染20秒钟，水洗、干燥、镜检。

本菌呈红色、背景为兰色。

（三）形态染色特性  革兰氏阴性球状或小而短杆菌，多单在，少短链，无运动性，不形成芽胞和荚膜。用科兹洛夫斯基鉴别染色法，本菌呈红色，其他杂菌呈绿色。

（四）培养特性  流产布氏杆菌和绵羊布氏杆菌初代分离需在5～10％CO₂环境中始能生长（也可用燃烛法）。在肝汤琼脂上，72小时形成细小湿润、闪光、圆形隆起菌落。

血清肝汤琼脂内做振荡培养，3～6天后布氏杆菌在距表面0.5cm处形成带状生长。

三、炭疽杆菌

可取病料（血液、水肿液、脾、淋巴结或人工感染小白鼠死亡后的肝）或培养物进行涂片，待自然干燥，火焰固定后，病料用美兰或瑞特氏染色，培养物用革兰氏染色，干后镜检，观察。

（一）形态染色特性  革兰氏阳性大杆菌。在组织标本（病料制片）中单个存在或呈短链排列，有荚膜，无芽胞，菌体呈杆状，两端相连处呈竹节状，在人工培养物标本中，细菌呈长链排列，无荚膜，有卵圆的中央或偏端芽胞。

（二）培养特性  在普通琼脂上培养24小时，生成灰白色、扁平、毛玻璃样不透明菌落，边缘不整齐，呈卷发状，明胶穿刺，呈倒立松树状。

四、猪丹毒

病料采集：可疑猪丹毒疹块型取皮肤,败血型采取肾、肝、脾、心血、淋巴结和骨髓等检验，在实验中常用本菌培养物（肉汤或固体培养基加生理盐水稀释）注射小白鼠或鸽（在鸽体内菌形很大）死后取肝、心血涂片，自然干燥后用瑞特氏或美兰染色（方法见实验二），待干后，镜检观察。

（一）形态染色特性  革兰氏阳性，平直或微弯的细小杆菌，细菌散在或簇集于白细胞中，在慢性猪丹毒心内膜疣状物上，多呈长丝状，不运动，不形成荚膜和芽胞。

（二）培养特性  在血琼脂上24～48小时后生成针尖大露滴样圆形小菌落，菌落无色透明，周围可形成狭窄的绿色溶血环。在普通琼脂上生长不佳，明胶穿刺不液化，呈试管刷状生长。

五、多杀性巴氏杆菌

尽可能采取新鲜病料（心血、肝、脾、淋巴结、骨髓等）制成涂片，在实验中，可用本菌的肉汤培养物注射小白鼠或鸡，死后，取肝涂片，自然干燥后，再用瑞特氏或碱性美兰染色，待干后镜检观察。

（一）形态染色特性  革兰氏阴性球杆菌，菌体两端钝圆，常单在，有时成双，组织抹片用碱性美兰或瑞特氏染色，干后镜检观察，本菌呈典型明显的两极着色。

（二）培养特性  血琼脂上生长良好，24小时可形成淡灰色、圆形、光滑湿润、边缘整齐露珠样小菌落，不溶血。