细菌的转导

2011-8-11 15:28:44 百度

一、基本知识与原理
转导是以噬菌体为媒介将一个细胞的遗传物质转移给另一个细胞的过程。随着分子遗传学的发展，转身已成为基因精细结构分析的常用方法之一。
根据噬菌体转导供体菌基因的差异，转导可分为普遍性转导和局限性转导。这里以局限性转导为例说明转导的基本原理。局限性转导实验中常用的是大噬菌体，它能整合在大肠杆菌染色体DNA上的半乳糖基因（gAl）和生物素基因（bib）之间，因此，它能转导半乳糖基因（一）又能转导生物素基因（bio）。
本实验选用大肠杆菌 E。oh K．2（A）为供体菌（即大噬菌体的DNA已整合在大肠杆菌的DNA上，我们称该大肠杆菌为溶源性大肠杆菌，’gAT””为带有半乳糖基因）。由于在此供体菌中噬菌体与半乳糖基因（匆”）紧密连锁，因此，当此供体菌受紫外线照射后会产生裂解反应，噬菌体被诱发释放，以一定的比例形成带有半乳糖基因的转导噬菌体。当这种转导噬菌体与受体菌 ECo］i K；。 s gAl－（此细菌不能利用半乳糖，‘’表示此细菌半乳糖基因发生突变）混合接触时，带有一基因的转导噬菌体能以一定的频率整合到受体首上，从而使不能利用半乳糖的 gAl一受体菌转变成了能利用半乳糖的 gAT”细菌。整个过程可用图12－’表示：l
二、实验目的和要求
以局限性转导为例来说明转导的基本原理，进一步验证是遗传物质，并初步掌握转导实验的基本方法。
三、实验器材
（1）实验材料：供体菌受体菌
（2）实验试剂：肉汤液体培养基、肉汤固体培养基、ZE 肉汤液体培养基、半固体琼脂培养基、半乳糖Emb培养基、灭菌生理盐水（或磷酸缓冲液）
D（3）实验设备：培养皿（9厘米）、三角烧瓶（50毫升）、试管、离心管，离心机，移液管，涂棒，水浴锅，离心机，紫外照射箱、温箱
四、实验方法与步骤
1 噬菌体的诱导和裂解液的制备
（1）供体菌的活化与培养，取—环供体菌，接种于盛有sml肉汤液体培养基的三角瓶中37度培养16h后，吸取0.5毫升菌液，接种于盛有肉4.5毫升肉汤液体培养基的三角瓶中，继续培养4～6小时。
（2）制备悬浮液将三角瓶中的菌液倒人离心管，以 3 500 rlmlN，离心 10 miN。离心后，除去上清液，加 4ml磷酸缓冲液，混匀沉淀，再以 3 smr/miN，离心 10。i。，这样反复洗三次，制备成悬浮液。
（3）诱导裂解：取悬浮液 3。；i于培养皿中，经 UV处理（15 W，距离 40Cm），诱导 10－20。
（4）避光培养； UV处理后，加人 3 ml ZE肉汤液体培养基，为了防止光复活，立即置于37 T避光培养 2－3 h．
（5）制备裂解液：吸取培养物于离心管中，以 3 500 r/rUiN，离心 10 miN，吸取上清液，再加人02 ml氯仿（4－5滴），激烈振荡30 s，静置5 mlN，再次以 3 55 r/miN，离心 10 mlN，小心把上清波用无菌吸管转移到另一试管，这就是噬菌体（A） gAl”的裂解液。
2转导方法
（l）点滴法：①取倒好Emb培养基的培养皿2只，在皿底用记号笔按图中的样子画好。
②取一满环受体菌，涂出一条菌带，共涂二条， 37 T培养 15 ho ＠取出培养皿
在2个圆圈和四个方格处，各加一环噬菌体裂解液，2个圆圈作为对照，四个方格作为
转导处理，见图 12—2，培养 2 D，观察结果。
3涂布法：①取倒好的Emb培养皿三只，先做好标记，其中一加 oJ ml噬菌体裂解液，用于对照Z一只加 oJ ml受体菌，也用于对照，一只加噬菌体裂解液和受体菌液各 005 ml、②用玻璃涂棒将各皿上的菌液（或噬菌体裂解液）涂开，相同的2只培养皿用同一根玻璃涂棒，37 T培养 2 D，观察结果。