目的要求

1．掌握细菌抹片的制备方法和几种常用的染色方法。

2．认识革兰氏染色的反应特性。

操作步骤

染色是细菌学上一个重要而基本的技术。由于细菌个体微小，且半透明，如不经染色往往不易识别。因此，借助于染色法可使细菌着色，与背景形成鲜明的对比，便于在显微镜下进行观察。也可根据不同的染色反应，作为鉴别细菌的一种依据。

一、载玻片处理

载玻片应清晰透明，清洁而无油渍，滴上水后，能均匀展开，附着性好，如有残余油渍，可按下列方法处理。

（一）滴上95％酒精2～3滴，用清洁纱布擦拭，然后以钟摆速度通过酒精灯焰3～4次。

（二）若上法仍未能除去油渍，可再滴上1～2滴冰醋酸，用纱布擦净，再在酒精灯火焰上轻轻拖过。

玻片洁净后，用玻璃铅笔在预涂材料处的背面划一个直径1.5cm的圆圈，用以标记。

二、涂片方法

（一）菌落涂片方法  涂片时，左手握菌种管，右手持接种环（又称铂金耳）取1～2环生理盐水，置于载玻片上，然后将接种环在火焰上灭菌，待冷后，从菌种管内钓取少许菌落，置于生理盐水中混匀，涂成直径1.5cm的涂膜，此膜既薄又均匀为好，待干即成。

（二）菌液涂片法  用灭菌接种环沾取菌液（液体培养物、血清、乳汁、组织渗出液等）1～2接种环，均匀涂抹在载玻片上,使成直径为1.5cm左右圆形或椭圆形涂膜，自然干燥后备用。

（三）血液涂片方法  先取一张干净无油垢边缘整齐的载玻片，其一端沾取少许血液，以45度角放在另一张干净无油垢的载玻片一端，从这端向另一端推成薄而均匀的血膜，待干后备用。

（四）组织涂片方法  先用镊子夹持组织局部，然后以灭菌剪刀剪取一小块，夹出后以其新鲜切面在载玻片上压印或涂成一薄层。

三、干燥

涂片最好在室温中自然干燥。必要时，可将标本面向上，在离酒精灯火焰远处烘干，切勿紧靠火焰，以免标本糊焦而不能检查。

四、固定

有两种固定方法

（一）火焰固定  将已干燥好的抹片，使涂面向上，以钟摆速度通过酒精灯火焰四次，使固定后的标本触及皮肤时，稍感烧烫为度。放置冷却后，进行染色。

（二）化学固定  血液、组织脏器等抹片作姬姆萨氏染色或单染色时，不用火焰固定而用甲醇固定，可将已干燥的抹片浸入甲醇中2～3分钟，取出晾干；或者在抹片上滴加数滴甲醇使其作用2～3分钟后，自然挥发干燥，抹片作瑞特氏染色时则不必作特别固定，染色液中含有甲醇可以达到固定目的。

抹片固定的目的是：

1．使菌体蛋白凝固附着在载玻片上，以防染色过程中被水冲掉。

2．改变细菌对染料的通透性，因活细菌一般不允许染料进入细菌体内。

3．能杀死抹片中的部分微生物。

必须注意，在抹片固定过程中，实际上并不能保证杀死全部细菌，也不能完全避免在染色水洗时不将部分涂抹物冲掉。因此，在制备烈性病原菌，特别是带芽胞的病原菌抹片和染色时，应严格处理染色用过的残液和抹片本身，以免引起病原的散播。

五、几种常用的染色方法

（一）单染色法  只应用一种染料进行染色的方法，如美蓝染色法。

美蓝染色法：在已干燥、固定好的抹片上，滴加适量的（足够覆盖抹片点即可）美蓝染色液，经1～2分钟，水洗，沥去多余的水分，吸干或烘干（不能太热），然后镜检。

（二）复染色法  应用两种或两种以上的染料或再加助染剂进行染色的方法。染色时，有些是将染料分别先后使用，有些则同时混合使用，染色后不同的细菌和物体或者细菌结构的不同部分，可以呈现不同颜色，有鉴别细菌的作用，又可称为鉴别染色，如革兰氏染色法，抗酸染色法，瑞特氏染色法和姬姆萨氏染色法等。

1．革兰氏染色法

（1）在已干燥，固定好的抹片上，滴加草酸铵结晶紫染色液，经1～2分钟，水洗。

（2）加革兰氏碘液于抹片上媒染，1～3分钟，水洗。

（3）加95％酒精于抹片上脱色，约30秒至1分钟，水洗。

（4）加10倍稀释石炭酸复红液复染1～2分钟，水洗。

（5）吸干或烘干，镜检。革兰氏阳性细菌呈蓝紫色，革兰氏阴性细菌呈红色。

2．抗酸染色法

（1）在已干燥，固定好的抹片上滴加较多量的石炭酸复红染色液，将玻片置酒精灯火焰上缓缓加热，至产生蒸汽即止（不要煮沸），维持微微产生蒸汽，经3～5分钟，水洗。

（2）用3％盐酸酒精脱色，直至标本无颜色脱出为止，充分水洗。

（3）用美蓝染色液复染约1分钟，水洗。

（4）吸干或烘干，镜检。抗酸性细菌呈红色，非抗酸性细菌呈蓝色。

3．瑞特氏染色法

抹片自然干燥后，滴加瑞氏染色液于其上，为了避免很快变干，染色液可稍多加些，或者看情况补充滴加，经1～3分钟，加约与染液等量的中性蒸馏水或磷酸盐缓冲液，轻轻晃动玻片，使与染液混匀，经3分钟左右，直接用水冲洗（不可先将染液倾去），吸干或烘干，镜检。细菌染成蓝色，组织、细胞等呈其他颜色。

4．姬姆萨氏染色法

（1）于5ml新煮过的中性蒸馏水中滴加5～10滴姬姆萨氏染色液原液，即稀释成为常用的姬姆萨氏染色液。

（2）抹片经甲醇固定并干燥后，在其上滴加足量的染色液或将抹片浸入盛有染色液的染色缸中，染色30分钟，或染色数小时至24小时，取出水洗，吸干或烘干，镜检。细菌呈蓝青色，组织、细胞等呈其他颜色。视野常呈淡红色。

5．荚膜染色法

（1）涂片、干燥  同单染色法。

（2）固定  滴加甲醇液于涂抹面上，固定2～3分钟。

（3）水洗  倾去甲醇液，用水轻微冲洗。

（4）染色  滴加碱性美兰染色液数滴于涂抹面上，染色2～3分钟。

（5）水洗  倾去染色液，用水轻微冲洗。

（6）干燥，镜检  菌体染成蓝色，荚膜染成粉红色或无色。

荚膜染色的原理：荚膜染色主要用于炭疽杆菌病料的荚膜检查。因为炭疽杆菌荚膜系由d-谷氨酸组成的多肽所构成，而菌体的主要成分则为核蛋白，因二者着色力不同，染色水洗后，则可把荚膜上一部分染料冲洗掉，颜色变淡，故显微镜检查时，在着色较深的菌体周围看到一圈呈淡紫色的膜，即荚膜。又因碱性美兰是一种多染性染料，故菌体染为蓝色，荚膜则染成淡蔷薇色。

6．芽胞染色法

（1）将有芽胞的材料作涂片、干燥、固定。

（2）将5％孔雀绿水溶液滴加于固定好的涂片上。

（3）用木夹夹住载玻片在酒精灯火焰上加热，使染料冒蒸汽（但不能煮沸），切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料。加热时间从冒蒸汽时开始计算约4～5分钟。

（4）倾去染色液，待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再退色为止。

（5）用0.5％沙黄水溶液复染1分钟，水洗。

（6）干燥或烘干后，置油镜观察，芽胞呈绿色，菌体呈红色。

7．鞭毛染色法之一

（1）涂片  取10～12小时的幼龄培养菌，用1％福尔马林水溶液制成菌液，在37℃温箱中固定24小时，涂抹于载玻片上。

（2）自然干燥，不固定。

（3）用下述染色液加温染色30秒到1分钟，然后静置1～2分钟。

（4）染色液配制

①0.5％苦味酸水溶液（加温溶解后过滤）1.0ml。

②20％鞣酸水溶液（加温溶解，不过滤）1.0ml。

③5％钾明矾水溶液（加温溶解后过滤）0.5ml。

④10％复红酒精溶液（配制后7天过滤）0.5ml。

上述染色液在用前，按①、②、③、④的顺序混合后，即可使用（染色液现配现用）。

（4）水洗、干燥、镜检。

（5）结果  菌体呈深红色，鞭毛呈淡红色。

8．鞭毛染色之二

（1）脱脂玻片的准备  要用新的或表面没有磨损痕迹的玻片。先用洗衣粉煮10～15分钟，取出玻片用清水洗净，再放入洗涤液中浸泡24小时左右，取出后，用自来水和蒸馏水洗净，再用95％酒精脱脂，用火焰烧去酒精，即可使用。如不立即使用，可在脱脂后放于干净的盒中，或浸泡于95％酒精中，用前在火焰上烧去酒精，冷却后使用。

（2）菌种  最好应用有冷凝水的新制琼脂斜面接种，培养10～12小时应用。如所用菌种久未移植，最好在这种斜面上每天移植一次，连续移植2～3次后使用。

（3）染色液的配制

甲液： 

单宁酸            5g

FeCl₃             1.5g

蒸馏水            100ml

15％福尔马林      2.0ml

1％NaOH          1.0ml

配好后，当天使用，次日效果差，第3天则不好用。

乙液： 

AgNO₃      2g

蒸馏水      100ml

待AgNO₃溶解后，取出10ml备用，再向余下的90mlAgNO₃中滴入浓氨水，使之成为很浓的氢氢化银，再继续滴加氨水变为透明，直到重新形成的沉淀物又刚刚溶解为止。再将备用的10ml AgNO₃慢慢滴入，则出现薄雾，但轻轻摇动后，薄雾状沉淀又消失，再滴入AgN0₃，直到摇动后仍呈现轻微而稳定的薄雾状沉淀为止。如所呈薄雾不重，即可使用，此染剂可使用一周。如雾过重、则银盐被沉淀出，不宜使用。

（4）染色方法  在载玻片一端加蒸馏水一滴，再用接种环钓取少量细菌于水滴中沾几下，将载玻片倾斜，使水滴流到另一端，然后将载玻片稍斜或平放，在空气中干燥后，在涂片上滴加甲液染色2～4分钟，用蒸馏水冲洗，将残水甩干，或用乙液冲去水后，再加乙液染色30～60秒钟，然后用蒸馏水冲洗，在空气中晾干，镜检。如未见鞭毛，应在整个涂片上多找几个视野，有时只在部分涂片上染出鞭毛来。如加乙液后，将载玻片在酒精灯上稍加热，使其微冒蒸汽且不干，则效果更好。

9．立克次氏体染色法

（1）涂片  以病料制成涂片。

（2）干燥、微加温固定。

（3）染色  滴加0.25％碱性复红水溶液（染色液调至pH7.2～7.4），用滤纸过滤,染色4分钟。

（4）脱色  用0.5％枸橼酸把多余的染色液洗脱掉。

（5）水洗

（6）复染  1％美兰水溶液复染数秒钟。

（7）水洗、干燥、镜检。

（8）结果  立克次氏体呈红色，其他组织细胞呈蓝色。