（一）细菌的分离培养

    1．培养基制作的原则和一般步骤

   （1）培养基制作的原则  培养基是人工方法将多种物质按照各类微生物生长 的需要而合成的一种混合营养料，一般用以分离和培养菌类。常用的培养基有基础培养基、增菌培养基、选择培养基、鉴别培养基等。在制作培养基时应掌握如下原则和要求：

①培养基必须含有细菌生长所需要的营养物质。

②必须彻底灭菌,不得含有任何活细菌。

③培养基的材料和盛培养基的容器上,没有抑制细菌生长的物质。

④所制备培养基应该是透明的，以便观察细菌生长性状和其它代谢活动所产生的变化。

⑤培养基的酸碱度应该符合细菌的生长要求，多数细菌生长适宜范围是弱碱（pH7.1~7.6）。

    （2）培养基制备的一般过程  不同的培养基其制备方法不同，一般要经如下步骤：

    ①根据不同的菌类和用途，选择适宜的培养基。

    ②精确称量各种成分。

    ③将各种成分按规定加热溶解，调整pH到适宜的范围内。再加热煮沸10~15分钟（注意补加液体的损耗）

    ④过滤（用滤袋或纱布棉花），分装、灭菌（不同的培养基的灭菌温度和时间不同，通常为15磅压力下15~30分钟）

    ⑤培养基中的某些成分，象血清、腹水、糖类、尿素、氨基酸、酶等，在高温下易分解，变性，故应用滤菌器过滤，再按规定的温度和量加入培养基中。

    ⑥无菌检验，取作好的培养基数管，置37℃恒温箱内24小时，若无细菌和霉菌生长即可使用。

    2．细菌的分离培养

    在细菌学诊断中，细菌的分离培养是不可缺少的一环，分离培养的目的是在病料中由多种细菌里挑选出可疑菌。在分离培养之前，首先应该注意下列事项：

（1）选择适合于所含分离细菌生长的培养基。

（2）培养温度一般在37℃，但应考虑特殊细菌对温度的要求。

   （3）考虑所分离的细菌是需氧性或厌氧性，进一步决定培养条件。

   （4）初步分离时发现有多种细菌，应进一步选择可疑菌落进行纯培养

（二）      细菌的接种

    1．平板划线法  此法为常用的细菌分离培养法。平板划线培养的方法甚多，可按各人的习惯选择应用，其目的都是将被检材料作适当的稀释，以求获得独立单在的菌落，防止发育成菌苔，以致不易鉴别其菌落性状。划线培养时须注意以下几点：

  （1）左手持皿，用左手拇指，食指及中指将皿盖揭开成20度左右的角度（角度愈小愈好，以免空气中的细菌进入皿中将培养基污染）。

  （2）右手持接种环，将材料少许涂布于培养基边缘，然后将接种环上多余的材料在火焰中烧毁，待接种环冷却后，再与涂材料之处轻轻接触，开始划线。

  （3）划线时先将接种环稍稍弯曲，这易和平皿内琼脂平行，不致划破培养基。

  （4）划线中不宜过多地重复旧线，以免形成菌苔。

  （5）平皿盖向下，在培养皿上标注样品名称、编号、接种日期后，置温箱中培养。

    2．斜面接种法

    3．液体培养基接种法

  （三）细菌培养性状观察

    1．细菌在液体培养基中生长性状观察

  （1）浑浊度  观察是否透明，轻度浑浊，中度浑浊或极度浑浊，还有均匀浑浊，颗粒状浑浊，絮状浑浊。

  （2）沉淀  试管底有无沉淀，沉淀物呈颗粒状，粘稠状或絮状。轻摇时云雾状，絮状或发辫状开起。

（3）表面  有无菌膜及附着于管壁的菌环。

    （4）色素及气味

    2．细菌在固体培养基上菌落生长性状观察

   （1）大小  各种细菌菌落大小差异很大，菌落直径在1毫米以下为露滴状菌落；1~2毫米为小菌落；2~4毫米为中等大菌落；4~6毫米或更大为大菌落。

   （2）形状  有圆形、规则形、根足形、菌丝状等。

（3）边缘  有整齐、锯齿状、纤毛状、卷发状等。

（4）表面  有光滑、湿滑、粗糙、颗粒状、皱丝状、同心状、放射状等。

（5）降起度  有角平、隆起、脐状、扭扣状。

（6）颜色  有无色、白色、灰白色、金黄色、柠檬色、绿色、红色等。

（7）透明度 有透明、半透明、不透明等。

    （四）显微镜检查——细菌抹片制备、染色及镜检

    细菌细胞微小，无色而半透明，原样直接在普通光学显微镜下观察，只能大致见到其外貌，制成抹片和染色之后，则能较清楚地显示其形态和特殊构造，也可以根据不同的染色反应，作为鉴别细菌的一种依据。

常应用各种染料对细菌进行染色，由于毛细管、渗透、吸附和吸收等物理作用，以及离子交换，酸碱等化学作用，染料就能使细菌着色，且因细菌细胞的结构和化学成分不同，而含有不同的染色反应。

    1．细菌抹片的制备

进行细菌染色之前，须先作好细菌抹片，其方法如下：

（1）玻片准备  载玻片应清晰透明、洁净而无油渍，滴上水后，能均匀展开，附着性好。如有油渍，可按下列方法处理：

①滴上95%酒精2~3滴，用洁净纱布揩擦，然后在酒精灯火焰上轻轻拖过几次。

    ②若上法仍未能去除油渍，可再滴上1~2滴冰醋酸，用纱布擦净，再在酒精灯火焰上轻轻通过。

（2）抹片  所用材料情况不同，抹片方法亦有差异。

液体材料（如液体培养物、血液、渗出液、乳汁等）可直接用灭菌接种环取一环材料，于玻片的中央均匀地涂布成适当大小的薄层。

不是液体材料（如菌落、脓、粪便等）则应先用灭菌接种环取少量生理盐水或蒸馏水，置于玻片中央，然后再用灭菌接种环取少量材料，在液滴中混合，均匀涂布成适当大小的薄层。

组织脏器材料，先用镊子夹持局部，然后以灭菌或洁净剪刀取一小块，夹出后将其新鲜切面在玻片上压积或涂抹成一薄片。

如有多个样品同时需要制成抹片，只要染色方法相同，亦可以在同一张玻片上有秩序地排好，作多点涂抹，或者先用蜡笔在玻片上划分成若干小方格，每方格涂抹一种样品，需要保留标本片，应贴标签，注明菌名、材料、染色方法和制片日期等。

（3）干燥  上述涂片，应让其自然干燥。

（4）固定  有两类固定方法。

    ① 火焰固定  将干燥好的抹片，使涂抹面向上，以其背面在酒精灯火焰上来回通过数次，略作加热（但不能太热，以不烫手背为度）进行固定。

    ② 化学固定  血液、组织脏器等抹片要作姬姆萨（Giemsa）染色，不用火焰固定，而应用甲醇固定，可将已干燥的抹片浸入甲醇中2~3 分钟，取出晾干；或者在抹片上滴加数滴甲醇使其作用2~3分钟后，自然挥发干燥。抹片如作瑞特氏染色（Wright’s stain），则必先须作特别固定，染料中含有甲醇，可以达到固定的目的。

将抹片固定的目的有如下几种：

①除去抹片的水分，涂抹材料能很好地贴附玻片，以免水洗时易被冲掉

②使抹片易于着色或更好地着色，因为死的蛋白质比活的蛋白质着色力较强。

    ③可能杀死抹片中的微生物。

    必须注意：在抹片固定过程中，实际上并不能保证杀死全部细菌，也不能完全避免在染色水洗时不将部分抹片冲脱。因此，在制备烈性病原菌，特别是带芽孢的病原菌的染色抹片时，应严格慎重处理染色用过残液和抹片本身，以免引起病原的散播。

固定好的抹片，即可进行各种方法的染色。

    2．几种常用染色方法

常用的细菌染色方法，主要有两种类型：

    （1）简单染色法  只应用一种染料进行染色的方法，如美蓝染色法。

    （2）复染色法   应用两种或两种以上的染料或再加媒染剂进行染色的方法。染色时，有些是将染料分别先后使用，有些则同时混合使用。染色后不同的细菌和物体，或者细菌构造的不同部分可以呈现不同的颜色，有鉴别细菌的作用，又可称为鉴别染色，如革兰氏染色法、抗酸性染色法、瑞特氏染色法和姬姆萨染色法。

    ①美蓝染色法  在已干燥、固定好的抹片上，滴加适量的（足够覆盖涂抹点即可）美蓝染色液，经1~3分钟，水洗，干燥（可用吸水纸吸干，或自然干燥，但不能烤干），镜检。

②革兰氏染色法

A．在已干燥、固定好的抹片上，滴加草酸铵结晶紫染色液，经1~2 分钟，水洗。

B．加革兰氏碘溶液于抹片上媒染，作用1~2 分钟，水洗。

C．加95%酒精于抹片上脱色，约0.5~1 分钟，水洗。

D．加稀释石炭酸复红（或沙黄水溶液）复染10~30秒，水洗。

E．吸干或自然干燥，镜检。革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色。

③ 抗酸染色法

    A．萋一尼（Ziehl-Neelsen）氏抗酸染色法  首先在已干燥、固定好的抹片上，滴加较多量的石炭酸复红染色液，在玻片下以酒精灯火焰微微加热至发生蒸气为度（不要煮沸），维持微微发生蒸气，经3~5分钟，水洗。然后用3%盐酸酒精脱色，至标本红色脱出为止，充分水洗。再用碱性美兰染色液复染约1分钟，水洗。最后吸干，镜检。抗酸性细菌呈红色，非抗酸细菌呈蓝色。

B．又法之一：将固定后的抹片滴加金（Kinyoun）氏石炭酸复红液，历3 分钟。此液配法为：

      碱性复红              4克        95%乙醇        20毫升

      石炭酸（化学纯）     9毫升        蒸馏水        100毫升

溶碱性复红于酒精，再缓缓加水并摇振，再加入石炭酸混合。

连续水洗1.5分钟后滴加加鲍脱（Gabbott）氏复染液历1分钟。此液配法为：

       美蓝             4克           无水乙醇          20毫升

       浓硫酸         20毫升            蒸馏水           50毫升

先将美蓝溶于乙醇，再加蒸馏水，再加硫酸。

连续水洗1 分钟，吸干，镜检。抗酸菌呈红色，其他菌呈蓝色。

C.又法之二：滴加石炭酸复红液于抹片（已干燥固定过的）上染1 分钟；水洗；再用1%美蓝酒精溶液复染20秒；水洗，干燥，镜检。抗酸菌红色。

镜检前对光检查染色片，标本片务必全呈蓝色。如标本片呈现红色或棕色，表示复染不足，应再作复染5~10 秒，再观察。如仍未全呈蓝色时，仍可反复复染，至符合要求为止。

    ④ 瑞氏染色法

    方法一：抹片自然干燥后，滴加瑞特氏染色液于其上，为了避免很快变干，染色液可稍多加些，或者看情况补充滴加，经1~3分钟，再加约与染液等量的中性蒸馏水或缓冲液，轻轻晃动玻片，使与染液混匀，经5分钟左右，直接用水冲洗（不可先将染液倾去），吸干或烘干，镜检。细菌染成蓝色，组织、细胞等物呈其他颜色。

方法二：抹片自然干燥后，按涂抹点大小，盖上一块略大的清洁滤纸片，在其上轻轻滴加染色液，至略浸过滤纸，并看情况补滴，维持不使变干；染色3~5分钟钟，直接以水冲洗，吸干或烘干，镜检。此法的染色液经滤纸滤过，可大大避免沉渣粘附抹片上而影响镜检观察。

⑤ 姬姆萨氏染色法

    A.于5毫升新煮过的中性蒸馏水中滴加5~10滴姬姆萨染色液原液，即稀释成 常用的姬姆萨染色液。

B.抹片经甲醇固定并干燥后，在其上滴加足量染色液或将抹片浸入盛有染色液的染色缸中，染色30分钟，或者染色数小时至24小时，取出水洗，吸干或烘干，镜检。细菌呈蓝青色，组织、细胞等呈其他颜色，视野常呈红色。

3.细菌基本形态及构造的观察

  （1）细菌的形态

   ①球菌：

    双球菌：注意其成双的排列，两个菌体接触面的形状以及菌体的形态。

链球菌：注意其链状排列，链的长短，个体的形态。

四联球菌：注意其四个联结成方形排列的形态。

八叠球菌：注意其八个堆叠一起，呈立体方形的形态。

葡萄球菌：注意其无一定次序，无一定数目，不规则地堆在一起的形态。

   ②杆菌：

单杆菌：注意其单个散在的状态，菌体外形、大小、菌端的形状。

双杆菌：注意其成双的排列以及菌体外形、大小、菌端的形状。

链杆菌：注意其成链状排列，链的长短，菌体外形、大小、菌端的形状。

    ③螺旋状菌：

弧菌：注意其弯曲成弧形以及菌体大小，菌端的形状。

螺菌：注意其具有两个弯曲以上的螺旋状及菌体的长度、大小，菌端的形状。

  （2）细菌的一些构造

    ①荚膜：注意荚膜的位置、形状、大小、染色及相互间的联结。

 ②鞭毛：注意鞭毛的形状、长度、大小、数目及其在菌体上的排列（单毛、丛毛、周毛）。

③ 芽孢：注意芽孢的形状，与菌体相比的大小以及在菌体中的位置（中央、偏端、末端）。

 ④异染颗粒：注意其与菌体不同的染色反应、形状、大小、多少、位置等。

（五）   动物试验

 为了作细菌或其它微生物的分离鉴定，致病力测定等，常用实验动物进行接种，常用的实验动物接种方法有下列数种。

1． 皮下接种

   （1）家兔皮下接种  由助手把兔伏卧或仰卧保定，于其背侧或腹侧皮下结缔组织疏松部分剪毛消毒，术者右手持注射器，以左手拇指、指食和中指捏起皮肤使成一个三角形皱褶，于其底部进针，感到针头可随意拨动即表示插入皮下。当压入注射物时感到流利畅通也表示在皮下。拔出注射针头时用消毒棉球压住针孔并稍加按摩。

   （2）豚鼠皮下接种  保定和术式同家兔。

   （3）小白鼠皮下注射  作小白鼠皮下注射接种无须助手帮助保定。术者在做好接种准备后，以右手捏取鼠尾，此时鼠头会向前挣扎而可以紧牵其尾，然后用左手的拇指和食指捏住其两耳及其头颈部皮肤使其翻转，背部皮肤固定于左手中指、无名指及拇指基部之间，以小指压住其尾根，小白鼠即仰卧保定于左手上。右手操作局部消毒，把持注射器，以针头稍微挑起皮肤插入皮下，注入时见有水泡微微鼓起即表示注入皮下。拔出针头后，同家兔皮下注射时一样处理。

    2．皮内接种  作家兔、豚鼠及小白鼠的皮内接种时，均需助手保定动物，其保定方法与皮下接种相同。接种时术者以左手拇指及食指夹起皮肤，右手持注射器，针头要很细，针头插入拇指与食指之间的皮肤内，针头插入不宜过深，同时针头插入角度要小，即与夹起的皮肤平行，注射时感到有阻力且注射完毕后皮肤上有小硬疱即为注入皮内的表现。皮内接种要慢，否则容易使皮肤胀裂或自针孔流出注射物而散播传染。

    3．腹腔内接种  在家兔、豚鼠及小白鼠的腹腔接种，宜采取仰卧保定。接种时其后躯应稍抬高使其内脏倾向前腔，接种部位在腹后侧面，针头先插入皮下，后进入腹腔，注射后皮肤应无疱隆起。其余术式同于皮下接种法。

    4．静脉注射

    （1）家兔的静脉注射  将家兔纳入保定器内或由助手保定兔体露出其头。选一侧耳边缘静脉，助手以拇指及食指紧压耳根部，使静脉努张，术者剪去静脉管上皮肤的毛，消毒局部，若需对同一动物作多次接种时，应自接近耳尖初处开始刺入接种，以后逐次接近耳根。接种时术者左手执兔耳，右手持针（针头不宜太细），以与静脉平行方向刺入静脉，同时助手放松其紧压手指，以便血液流通。注射时无阻力且有血向前流即表示注入静脉。缓缓注射，注射完针头拔出后，用消毒棉球紧压针孔片刻，以免流血或注射物溢出。

    （2）豚鼠静脉内接种  豚鼠静脉内接种比较困难，因为豚鼠没有裸露明显的静脉可寻，若必须作注射时，使豚鼠伏卧保定，腹面向下，将其后肢剃毛，用70%酒精消毒皮肤，施以全身麻醉，用锐利刀片向后肢内上侧向外下方切一长约一厘米的切口，使露出皮下静脉，用最小号针头（26号），刺入静脉慢慢注入接种物。接种完毕，皮肤应缝合一两针。

    （3）小白鼠静脉接种  作小白鼠静脉内接种时，选尾侧静脉，体重在15~20克为宜。因其尾部皮肤比较柔软、菲薄，静脉管清晰可见，若体重在20克以上时，尾部皮肤较厚、较硬，对缺乏经验的人更难于注射好。接种时用一玻璃杯扣住小白鼠，露出尾部，用最小号针头刺入尾侧静脉，缓缓注入接种物，注射时无阻力，皮肤不变白、不隆起，表示注入到静脉内。