康腹止泻片微生物限度检查法验证

2011-9-23 11:59:42 中国论文下载中心

【摘要】目的建立康腹止泻片微生物限度检查法。方法采用培养基稀释法。结果该法能有效消除康腹止泻片在检验条件下对细菌、真菌及酵母菌的抑制作用;控制菌可用常规法检查。结论该法简单、快捷，可用于康腹止泻片的微生物限度检查，有效控制其质量。

【关键词】康腹止泻片;微生物限度检查;培养基稀释法

康腹止泻片是由木馏油、老鹳草粉、黄柏干浸膏等药材经加工而成的中成药片剂。本品味特异，具有化滞止泻功效。用于饮食不节或水土不服导致的食欲不振、恶心呕吐、腹胀腹泻、消化不良等症。处方中的老鹳草、黄柏具有一定的抑菌作用[1，2]，若用常规法对其进行微生物限度检查，结果将不能真实反映样品的污染情况[3]。为此，根据《中国药典》2010年版的有关规定[4]，对康腹止泻片微生物限度检查方法进行验证，以确定其是否适用于本品的微生物限度检查，从而准确有效地检出样品中污染的微生物[5]。验证表明，采用培养基稀释法对本品进行检查，可使污染的微生物能被顺利检出，常规法则可用于控制菌的检查。该方法简便、快捷、准确、可行，能有效控制康腹止泻片的质量，并可为同类药品的微生物限度检查法提供科学的实验依据。

　　1 仪器与试药

　　1.1 菌种

　　金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、大肠埃希菌[CMCC(B)44102]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、白色念珠菌[CMCC(F)10123]，均购自中国药品生物制品检定所;黑曲霉(ATCC16404)购自广东省微生物研究所。

　　1.2 培养基

　　营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、改良马丁培养基、改良马丁琼脂培养基、胆盐乳糖培养基。

　　1.3 供试品

　　康腹止泻片(批号41EA1)，大幸药品株式会社。

　　2 方法与结果

　　2.1 菌液的制备[4]

　　2.1.1 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌

　　取新鲜培养物接种至营养肉汤培养基中，培养18～24 h;培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1 mL含菌数为50～100 cfu的菌悬液。用于控制菌验证时制成每1 mL含菌数为<100 cfu的菌悬液。

　　2.1.2 白色念珠菌取新鲜培养物接种至改良马丁培养基中，培养24～48 h;培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1 mL含菌数为50～l00 cfu的菌悬液。

　　2.1.3 黑曲霉取新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养5～7 d，加入0.9%无菌氯化钠溶液3～5 mL，将孢子洗脱。然后，用适宜的方法吸出胞子悬液至无菌试管内，用0.05%(体积分数)聚山梨醇的0.9%(体积分数)无菌氯化钠溶液制成每l mL含孢子数50～100 cfu的孢子悬液。

2.2 供试液的制备

　　取样品10 g，加入pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液至100 mL，用匀浆仪打碎，摇匀，制成1∶10的供试液。

　　2.3 验证试验

　　验证实验所用培养基均按《中国药典》2010年版附录“微生物限度检查法”要求，进行培养基适用性检查，且均符合规定。

　　2.3.1 细菌、真菌及酵母菌计数(平皿法培养基稀释法) 在确定适合的检查方法后，验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。

　　试验组:各取1∶10供试液1、0.5、0.2 mL和试验菌液1 mL，分别注入平皿中，立即倾注相应琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。

　　菌液组:取试验菌液1 mL注入平皿中，立即倾注相应琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，测定所加的试验菌数。

　　供试品对照组:各取1∶10供试液1、0.5、0.2 mL，按试验组操作，不加菌液，测定样品本底菌。

　　计算各试验菌株的回收率，结果见表1。表1 计数验证菌各菌株回收率结果

　　由表1可见:黑曲霉的回收试验，当供试液为1 mL·皿-1时，3次试验的回收率均即可达到70%以上;白色念珠菌当稀释至0.5 mL·皿-1时，3次试验的回收率达到70%以上;而大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌3个菌株的回收率试验，要稀释至0.2 mL·皿-1，3次验证的回收率才能均达到70%以上。因此本品的细菌计数、真菌及酵母菌计数均可用培养基稀释法检查:细菌计数用0.2 mL·皿-1，真菌及酵母菌计数用0.5 mL·皿-1。

　　2.3.2 控制菌检查法的验证本品为含有药材粉末投料的口服制剂,控制菌应检查大肠埃希菌和大肠菌群，验证大肠菌群检查法时，采用大肠埃希菌作为试验菌。

　　2.3.2.1 大肠埃希菌检查法的验证取1∶10供试液10 mL及大肠埃希菌菌液1 mL加入100、200 mL的BL增菌培养基中，按大肠埃希菌的检查法进行检验。

　　2.3.2.2 大肠菌群检查法的验证取1∶10供试液1 mL及大肠埃希菌菌液1 mL加入不少于15、30 mL的胆盐乳糖发酵培养基中，按大肠菌群的检查法进行检验。

　　由表2可知，试验组均检出大肠埃希菌，因此本制剂的大肠埃希菌和大肠菌群均可用常规法检查。

　　4 讨论

　　本品含有木馏油、阿仙粉、黄柏粉等成分，有一定的抑菌作用，验证试验结果证明，本品对革兰阳性菌有较强的抑制作用。药典收载的除去供试品抑菌作用的方法有培养基稀释法、薄膜过滤法、离心沉淀法等，或几法联用。由于本品是中成药，推断其抑菌作用不会太强，因此尝试采用培养基稀释法，通过扩大培养基的使用量，使供试品在培养基中稀释，结果各规定菌株的回收率均达到药典要求;控制菌则用常规法即能顺利检出试验菌。培养基稀释法操作简单，不需要特殊仪器设备，只需增加培养基量，即可很好地消除本制剂在试验条件下的抑菌作用问题，因此本方法简便快捷、准确有效，能很好地控制康腹止泻片的质量。表2 控制菌验证结果

作者：朱文娟，林铁豪，钟燕飞，林丽英

【参考文献】

　[1] 金晴昊，崔京浩，郭健鹏.老鹳草的研究[J].时珍国医国药，2005，16(9)：840-841.

　　[2] 金建玲，栾永娜，华国强.含小檗碱中药的抑菌活性与小檗碱含量的关系[J].中医药学报，2005，33(5):19-21.

　　[3] 许华玉，杜鹃，汤杨.药品中微生物污染检测方法验证的必要性[J].中国药品标准，2005,6(4):262,46-47.

　　[4] 国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版一部[M].北京:中国医药科技出版社,2010:附录79.

[5] 林丽英,湛文青,饶春意.野牡丹止痢片微生物限度检查法的建立[J].中药材,2006,29(3):299-302.