【摘要】  目的 分离纯化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis ZY-1)溶栓酶,探讨该酶的理化性质。 方法 枯草芽孢杆菌培养,利用(NH4)2SO4沉淀、Sephadex G-100 柱层析对该酶发酵液进行分离纯化,利用四肽底物Sue-Ala-Ala-Pro-Phe-PNA作为底物,研究酶的理化性质。 结果 经发酵并纯化后获得的酶液其比活高达26 400 U/mg,酶反应最适温度45 ℃,最适pH 8.0,且具有较好的热稳定性。 结论 枯草芽孢杆菌溶栓酶具有溶血栓作用。

【关键词】  芽孢杆菌,枯草; 纤溶酶

    ABSTRACT:  Objective  Purification of a fibrinolytic enzyme produced from Bacillus subtilis ZY-1 and investigation of its activity and characterization.  Methods  A high fibrinolytic enzyme was purified with (NH4)2SO4 fractionation and sephadex G-100 gelfiltration chromatography, and characterization was investigated by check the enzymatic activities in different conditions.  Results  The specific activity of enzyme was 26 400 U/mg, and its optimal temperature and pH was 45 ℃ and 8.0, respectively.  The enzyme had fine thermal heat stability.  Conclusion  The enzyme had potential commercial value.
   
　　KEY WORDS:  Bacillus subtilis; plasmin

    目前常用治疗血栓病的药品有链激酶(SK)、尿激酶(UK)、重组组织纤溶酶原激活剂(t-PA)和尿激酶原(pro-UK)等［1］。但它们在不同程度上存在不足,如SK的抗原性强,不可连续用药超过7 d,UK虽然可连续使用半个月无抗原性,但体内半衰期仅3~20 min,且长期大量用药有全身性出血的倾向,口服一般无效［2-4］。1987年日本学者在传统发酵食品纳豆中发现一种由枯草芽孢杆菌产生的具有强烈纤溶活性的丝氨酸蛋白酶,定名为纳豆激酶(nattokinase,NK)［5］,该酶口服可通过肠道迅速吸收并释放入血,溶栓效率高,药效时间长,有望开发成新型口服溶栓剂［6-7］。本课题组在豆豉食品中筛选出一株产溶栓酶活性很高的枯草芽孢杆菌,探讨其产酶条件、提取工艺等以期提高其溶栓酶活性和产量。笔者报告该酶的分离纯化及其酶学性质。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料 

　　菌株:依据中国豆豉生产方法,制作豆豉［8］,经发酵实验,从中筛选出1株在发酵产物中产生高纤溶活性蛋白酶的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis ZY-1)作为出发菌株。试剂:凝胶Sephadex G-100(美国Pharmacia公司);底物Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA(英国NEB公司);牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G-250(美国Amresco公司);其他试剂均为国产分析纯。LB培养基:1%胰蛋白胨,0.5%酵母粉,1%NaCl。固体LB培养基:1%胰蛋白胨,0.5%酵母粉,1%NaCl,2%琼脂粉。发酵培养基:2%大米粉,4%豆粕粉,0.04%CaCl2,0.4%K2HPO4,0.2%KH2PO4,0.07%MgSO4。在发酵培养基100 mL中接种液体菌种6 mL,37 ℃,摇床转速为180 r/min,发酵72 h。

　　1.2  方法

　　1.2.1  溶栓酶分离纯化 

　　取含溶栓酶的发酵液,经9 000 r/min离心、30%~70%(NH4)2SO4分步沉淀,9 000 r/min再离心,沉淀用0.02 mol/L Tris-HCl (pH 7.2)缓冲液溶解后透析浓缩得粗酶液［9］。Sephadex G-100 柱(上海华美实验仪器厂)层析分离纯化溶栓酶:按常规方法处理的Sephadex G-100装入层析柱(1.5 cm×45 cm),用0.02 mol/L HCl-Tris (pH 7.2)缓冲液平衡。将已浓缩的粗酶液1 mL加入柱中,以相同缓冲液1 mL/min流速洗脱,以每1 mL/min为一管分部收集,用四肽底物法检测洗脱液,收集含有活性的组分。

　　1.2.2  SDS-PAGE分析 

　　制备12%分离胶,5%浓缩胶,上样量20 μL,30 mA稳流电泳(DYY-11型电泳仪,北京市六一仪器厂),用考马斯亮蓝R250染色［10］。

　　1.2.3  溶栓酶活性测定 

　　在四肽底物Sue-Ala-Ala-Pro-Phe-PNA溶液中加入豆豉溶栓酶酶液1 μL(稀释10倍),37 ℃中孵育1 min,测定单位时间内405 nm处光吸收的变化。酶的活性单位定义为:1 min水解该四肽底物生成1 μmol对硝基苯胺的豆豉溶栓酶量为1 U。

　　1.2.4  溶栓酶性质检测 

　　利用四肽Sue-Ala-Ala-Pro-Phe-PNA作为底物,研究温度、pH值、金属离子、有机溶剂对该酶的影响。

　　1.2.4.1  热稳定性 

　　取酶液1 μL和1 mmol/L底物49 μL溶于0.02 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液50 μL,在不同温度(25,35,45,55,65,75,85 ℃)下反应1 min测定酶活性。

　　1.2.4.2  pH值 

　　取酶液1 μL和1 mmol/L底物49 μL分别溶于不同pH的缓冲液50 μL (pH 4.0,5.0为0.05 mol/L醋酸缓冲液,pH 6.0,7.0,7.5,8.0为0.05 mol/L磷酸缓冲液,pH 9.0,10.0为0.05 mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液,pH 11.0,12.0为0.05 mol/L磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液)于37 ℃反应1 min,测定酶活性。

　　1.2.4.3  金属离子 

　　取酶液1 μL和1 mmol/L NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2等溶液10 μL溶于0.02 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液40 μL,于37 ℃静置30 min,分别加入1 mmol/L底物49 μL,于37 ℃反应1 min,测定酶活性。

　　1.2.4.4  有机溶剂 

　　以甲醇、乙醇、异丙醇3种不同有机溶剂为效应物,测定酶活性。

　　1.2.5  溶栓酶体外对血凝 

　　奶牛体表采血。取4支装有血液1 mL的试管分别加入等体积的稀释倍数不同的酶液，将其放入在37 ℃水浴锅中保温10 min后观察。

    2  结  果

　　2.1  枯草杆菌溶栓酶的纯化 

　　溶栓酶在第2个洗脱峰(图1)。纯化结果见表1。纯化倍数3.41,回收率10.29%。表1  溶栓酶的纯化（略）

　　2.2  溶栓酶的SDS-PAGE 

　　溶栓酶经纯化步骤后得到纯酶,其相对分子质量为32 kD(图2)。

　　2.3  溶栓酶的理化性质

　　2.3.1  最适温度 

　　溶栓酶活性最大时的温度为45 ℃(图3)。

　　2.3.2  热稳定性 

　　溶栓酶在<45 ℃保持稳定,达99％。55 ℃活性有所丧失(约7％),>65 ℃活性全部丧失。酶液反复在－20 ℃冻融4次,活性仍保持在93%以上。

　　2.3.3  最适pH 

　　溶栓酶活性最大时的最适pH为8.0(图4)。

　　2.3.4  pH稳定性 

　　酶液中加入1 mmol/L底物49 μL,溶栓酶在pH 7.0~10.0较稳定,酶活性>90％。

　　2.3.5  金属离子的影响 

　　Na+,K+,Ca2+,Mg2+,Cu2+,Fe3+对溶栓酶有一定的抑制作用,Mn2+，Ba2+对溶栓酶有较强的抑制作用(酶活性<40％),Al3+,Zn2+可提高溶栓酶的活性(酶活性112％和118％)。

　　2.3.6  有机溶剂的影响 

　　以甲醇、乙醇、异丙醇3种不同有机溶剂为效应物,研究有机溶剂对溶栓酶活性的影响。当甲醇浓度在10%~15%时,相对酶活性下降达30％。但随浓度继续增大,相对酶活性变化趋于平稳。乙醇在浓度<20%时,对酶活性略有激活作用;当浓度为10%时激活作用达到最大,可使酶活性提高13%;当浓度>20%时,酶的活性反而被抑制。异丙醇对溶栓酶总体表现为激活作用,其在所选择的有机溶剂中,激活作用最强,尤其在低浓度时(<5%),使酶活性提高70%,但随浓度的增大,激活作用渐渐减弱。当浓度>25%时,开始抑制酶的活性。

　　2.3.7  溶栓酶体外对血凝的影响 

　　管1所加酶液浓度最高,试管内的血液仍为均匀的流体体系。管2~4血液不是均匀体系,试管底部均有不溶血块,其大小依次增大(图5),说明溶栓酶体外对抗凝血的作用随酶液浓度的增大而增大。

　　3  讨  论

　　3.1  豆豉溶栓酶是从中国传统食品中发现的新型溶栓酶,具有较高的纤溶活性,且安全无毒,持续时间长，相对分子质量小,可通过消化道直接吸收［4,11］。本研究利用(NH4)2SO4沉淀、Sephadex G-100柱层析对该酶发酵液进行分离纯化,酶的得率为10.29,相对较低,主要原因是在纯化过程中操作步骤较多,损失较多,今后将继续摸索条件,控制纯化的工艺条件提高酶得率。

　　3.2  本研究所得枯草芽孢杆菌产生的溶栓酶的最适反应温度和pH为45 ℃和8.0,具有一定的热稳定性。由于胃中的pH环境呈酸性,所以本研究开发的溶栓酶不适于口服,应考虑取注射液形式。该酶的米氏常数（Km）、最大反应速度（Vmax）等酶反应动力学常数特征有待进一步研究。

　　3.3  基于非水酶学的兴起,本实验以甲醇等3种不同有机溶剂为效应物,研究在不同有机溶剂的不同浓度下,溶栓酶催化活性的变化趋势。实验发现,甲醇对溶栓酶的效应表现为抑制作用;乙醇在低浓度时略有激活作用,但在达到一定浓度(>20%)后酶活性反而被抑制,且抑制作用明显强于甲醇。甲醇和乙醇均属于亲水性有机溶剂,它们对酶的抑制作用可能是由于有机溶剂剥夺了酶周围的水化层,致使由水分子直接或间接参与形成的氢键、疏水键及范德华力等受到破坏,从而引起酶构象的剧烈改变而使酶活性下降。而异丙醇对酶的激活效应,可能是由于它们能介入酶分子的内部,改变酶分子所处环境的介电常数,引起肽链伸展,从而改变了酶活性中心必需基团所处的微环境极性,影响了酶的催化活性。

　　3.4  本实验以牛血为对象,观察不同浓度酶液对血凝的影响,随着酶液稀释倍数的增大,其抗凝血作用减弱,证明从本实验枯草芽孢杆菌LD-8547发酵后所提取的酶液具有溶血栓作用,具有开发应用价值。

【参考文献】
  　［1］付 利,杨志兴．纳豆激酶的研究与应用［J］. 生物工程进展, 1995,15(5):46-49.

　　［2］Nakajima N,Taya N,Sumi H. Potent fibrinolytic enzyme from the lysate of Katsuwonus pelamis digestive tract(Shiokara):purification and characterization［J］. Biosci Biotech Biochem, 1993,57(9):1604-1605．

　　［3］徐 仲,赵晓东,郑稚莺,等. 纳豆激酶的纯化及活力测定［J］. 生物技术, 1997,7(1):16-18.

　　［4］Pannall R. Pro-urokinase,A study of its stability in plasma and of a mechanism for its seletivite fibrinolytic effect［J］. Blood, 1986,67(1):12-15.

　　［5］Sumi H,Hamada H,Tsushima H,et al. A novel fibrinolytic enzyme(nattokinase) in the vegetable cheese natto. A typical and popular soybean food in the Japanese diet［J］. Experimenfia, 1987,43(20):1110-1111.

　　［6］Fuj M,Hong K,Ho Y,et al. Transport of nattokinase across the rat intestinal tract［J］. Biol Pharm Bull, 1995,18(9):1194-1196.

　　［7］Kim W,Choi K,Kim Y,Park H,et al. Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced from Bacillus sp. strain CK 11-4 screened from Chungkook-Jang［J］. Appl Envimnm Microbiol, 1996,62(7):2482-2488.

　　［8］董明盛,江 晓,刘 诚,等. 胞外纤溶酶产生菌的筛选及其产酶条件研究［J］. 食品与发酵工业, 2002,27(1):23-27.

　　［9］阎家麟,童 岩,臧莹安. 豆鼓纤溶酶的纯化及其性质研究［J］. 药物生物技术, 2000,7(3):149-152.

　　［10］肖 璐,张仁怀,张义正. 豆鼓溶栓酶工程菌的发酵条件及重组溶栓酶的分离纯化［J］. 食品与发酵工业, 2004,31(1):66-69.

　　［11］Omura K,Hitosugi M,Kaketani K,et al．Biofactors,fibrinolytic and anti-thrombotic effect of NKCP,the protein layer from Bacillus subtilis(natto)［J］. Biofactors, 2004,22(1-4):l85-l87.