一、灭菌

1有菌范畴：凡是暴露的物体，接触水源的物体，其表面都有菌。依此未处理的无菌室、超净台表面、未灭菌的培养基、容器表面、接种刀剪、身体外表及呼吸道等，都是有菌的。

2菌的种类及特点：包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其它微生物。其特点是：极小，肉眼看不见。无处不在，无时不有，无孔不入。忍耐力(热、射线、酸碱、有毒药剂等)强，生活要求简单，繁殖力极强。

3无菌范畴：经高温灼烧或一定时间蒸煮等物理方法处理，或化学药剂处理，高层大气、岩石内部、健康组织内部，强酸强碱，化学元素灭菌剂等。无菌世界要比有菌世界小得多。

4灭菌:指用理化方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有生命的物质全部杀死。

5消毒：指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用，即一些不会完全杀死，还有活着的微生物。

6无菌操作：在通过严格灭菌的操作空间（接种室、超净台等）和使用的器皿内，以及操作者外表都不带任何活着的微生物条件下，进行操作叫做无菌操作。

7组培无菌的要求：必须彻底无菌，比微生物培养还严格，因为培养基营养丰富，温度和湿度等合适。要彻底灭菌，必须根据不同的对象采取不同的切实有效的方法灭菌。

8灭菌方法可分为物理的和化学的两类：

(1)物理方法：如干热（烘烧和灼烧）、湿热（常压或高压蒸煮）、射线处理（超声波、微波）、过滤、清洗和无菌水冲洗等措施。

(2)化学方法：升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精等。

一．培养基用湿热灭菌 

培养基在制备后的24小时内完成灭菌工序。

1高压灭菌原理：在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃。可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。

    2保证高压：1)注意完全排除空气，常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上升到0.05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。2)保压到位，维持压力0.1～0.15MPa 20min。

因容器不同，保压时间而不同

表4－１培养基高压蒸气灭菌所必需的最少时间

培养基要严格遵守保压时间，既要保压彻底，又要防止培养基中的成分变质或效力降低，不能随意延长时间。

3对其它物品灭菌：无菌水、栽培介质、接种用具、滤纸、实验服、口罩等，可以延长灭菌时间或提高压力。这些物品用耐高压塑料袋装好，或用引报纸或牛皮纸包好。

4引起变化：培养基pH值下降0.2～0.3 单位。培养基中成分单一时pH值变化幅度较大，甚至可大于2个pH单位；升高渗透压：因铁使蔗糖水解为单糖，占15％～25％，约升高0.43倍。PH值小和加入活性碳，蔗糖水解增加。

二.无菌操作器械采用灼烧灭菌

对镊子、剪子、解剖刀、瓶口等用灼烧灭菌。若浸入95%的酒精中，然后再灼烧，效果更好。灼烧要完全彻底。

三.玻璃器皿及耐热用具采用干热灭菌

1原理：利用烘箱加热到160～180^０Ｃ的温度来杀死微生物，通常采用170^０Ｃ持续90min来灭菌。由于在干热条件下，细菌的营养细胞的抗热性大为提高，接近芽孢的抗热水平，

2处理：先洗净并干燥，对工具等要用耐高温的塑料妥为包扎；灭菌时应渐进升温；烘箱内放置的物品的数量不宜过多；到时断电要待充分冷凉，

3特点：耗能源，费时间。成本较低。

   四 不耐热的物质采用过滤灭菌

1适用种类：赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生素由于不耐热，可用过滤法。

2过滤方法：防细菌滤膜的网孔径为0.45μm以下，细菌的细胞和真菌的孢子等因大于孔径而被阻，液量大时，常使用抽滤装置；液量小时，可用注射器。