五.空间灭菌采用紫外线和熏蒸灭菌

1.紫外线灭菌

1)适宜：接种室、超净台的空间。只适于空气和物体表面的灭菌

2)原理：细菌吸收紫外线后，蛋白质和核酸发生结构变化，引起细菌的染色体变异，造成死亡。

3)特点：紫外线的波长为200～300nm，其中以260nm的杀菌能力最强，但是紫外线的穿透物质的能力很弱，所以只适于表面灭菌，且要求距照射物以不超过1.2m为宜．

2.熏蒸灭菌 ‘

1)概念：用加热焚烧、氧化等方法，使化学药剂变为气体状态扩散到空气中，以杀死空气和物体表面的微生物。这种方法简便，只需空间关闭紧密。

2)原理：使微生物的蛋白质变性，或竞争其酶系统，或降低其表面张力，增加菌体细胞浆膜的通透性，使细胞破裂或溶解。

3)特点：一般说来，温度越高，作用时间越长，杀菌效果越好。浓度越大，杀菌能力越强，但石炭酸和酒精例外。另外，消毒剂必须制成水溶状态。墙壁先喷湿会加强效果。房间要关闭紧密。

4)药品：常用熏蒸剂是甲醛,熏蒸时，按5～8ml/m³用量，加５g/m³高锰酸钾促氧化挥发。冰醋酸也可，但不如甲醛。

   6.一些物表用药剂喷雾或擦拭灭菌

   物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。如桌面、墙面、双手、植物材料表面等，可用70％的酒精反复涂擦灭菌，１％～２％的来苏儿溶液以及0.25～１％的新洁尔灭也可以。

   7. 植物材料表面用消毒剂灭菌 

    植物材料必须经严格的表面灭菌处理，再经无菌操作手续接到培养基上，这一过程叫做接种。接种的植物材料叫做外植体。

    第一步是清洗 把材料切割成适当大小，即灭菌容器能放入为宜。置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时，易漂浮或细小的材料，可装入纱布袋内冲洗。洗时可加入洗衣粉或表面活性物质－吐温助洗，最后用自来水冲净。

第二步是表面浸润。严格要求要在超净台内完成，准备好消毒的烧杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、无菌水、手表等。用70%酒精浸30秒左右。 

作用：使植物材料表面被浸湿。但要把握时间。70%酒精穿透力强，对特殊的材料，如果实、花蕾、包有苞片、苞叶等的孕穗，多层鳞片的休眠芽等，以及主要取用内部的材料，可处理稍长一些。

第三步是灭菌剂处理。表面灭菌剂的种类较多，可根据情况选取(见下表)

表4-2 常用灭菌剂使用浓度及效果比较表

次氯酸钠和次氯酸钙在使用前临时配制，都是利用其分解产生氯气来杀菌，故灭菌时用广口瓶加盖较好；灭菌效果次于氯化汞，得易于去除。

氯化汞可短期内贮用。氯化汞也称升汞，为剧毒物质，它由重金属汞离子破坏微生物蛋白质等来达到灭菌目的；特点是灭菌效果好，得去除残毒较难，应当用无菌水涮洗8～10次，每次不少于3min，

过氧化氢是分解中释放原子态氧来杀菌的，这种药剂残留的影响较小，灭菌后用无菌水涮洗3～4次即可；而

灭菌作法：沥干的植物材料转到较大器皿中，倒入消毒液开始记时，并不断用玻璃棒轻轻搅动，以驱除气泡促进接触和消毒彻底。用倾倒法灭菌液要充分浸没材料。

   灭菌液中可加吐温-80或Triton X，使药剂更易于展布和浸入到的材料表面。一般加入灭菌液的0.5%，即在100ml加入15滴。

最后一步是用无菌水涮洗，作用是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用。涮洗要每次3min左右，视情况，涮洗3～10次左右。

二、无菌操作

接种时由于有一个敞口的过程，所以是极易引起污染的时期，这一时期主要由空气中的细菌和工作人员本身引起，接种室要严格进行空间消毒。接种室内保持定期用1-3%的高锰酸钾溶液对设备、墙壁、地板等进行擦洗。除了使用前用紫外线和甲醛灭菌外，还可在使用期间用70%的酒精或3%的来苏儿喷雾，使空气中灰尘颗粒沉降下来。工作人员进入接种室前双手必须进行洁净，先用水和肥皂洗涤，操作前再用70%酒精擦试，操作时双手不能随便接触未经消毒的东西。入室前穿好灭菌的专用实验服和换托鞋，专用实验服要经常保持清洁并消毒。头发带的灰尘也很多，因此应戴上专用帽子。工作人员的呼吸也是污染的主要途径，操作规程过程禁止不必要的谈话和咳嗽，可带上口罩。还要尽量减少工作人员在接种室内的走动。

操作期间,尽量把所用的器皿盖子盖好。刀、剪、镊子等用具，一般在使用前浸泡在７０％的酒精中，用时再在火焰上消毒，待冷却后使用。每次使用前均需进行用具消毒。工作结束，及时取出接种材料，然后清理台面，再用５％的来苏儿或石炭酸全面喷雾或打开紫外线照射半小时。

三、接种

    接种是将已消毒好的根、茎、叶等离体器官，经切割或剪裁成小段或小块，放入培养基的过程。以上已叙述接种前的材料表面的消毒灭菌，现将接种前后的程序连贯地介绍。

(一)将初步洗涤及切割的材料放入烧杯，带入超净台上，用消毒剂灭菌，再用无菌水冲洗．最后沥去水分，取出放置在灭过菌的４层纱布上或滤纸上。

（二）材料吸干后，一手拿镊子，一手拿剪子或解剖刀，对材料进行适当的切割。如叶片切成0.5cm见方的小块；茎切成含有一个节的小段。微茎尖要剥成只含1～2片幼叶的茎尖大小等。在接种过程中要经常灼烧接种器械，防止交叉污染。

（三）用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上。具体操作是：先解开包口纸，将试管几乎水平拿着，试管口靠近酒精灯火焰，将管口在火焰上方转动，让管口里外灼烧数秒钟，若用棉塞盖口，可先在管口外面灼烧，去掉棉塞，再烧管口里面。然后用镊子夹取一块切好的外植体送入试管内，轻轻插入培养基上。若是叶片直接附在培养基上，以放1～3块为宜。至于材料放置方法除茎尖、茎段要正放（尖端向上）外，其它尚无统一要求。放置材料数量现在倾向少放，通过统计认为：对外植体每次接种以一支试管放一枚组块为宜，这样节约培养基和人力，一旦培养物污染可以抛弃。接完种后，将管口在火焰上再灼烧数秒钟。若用棉塞，塞好后，包上包口纸，包口纸里面也要过火。