花药培养

 花药培养改变花粉的发育程序，使其分裂形成细胞团，进而分化成胚状体，产后再生植株，或形成愈伤组织，由愈伤组织再分化成植株。

 1.1 花药的材料选择

一般选择单核期　此时细胞核较大居中，称单核中央期。随着细胞体积迅速增大，细胞核由中央位置推向一边，即单核靠边期。以上均为单核期花粉。

单核期的确定　根据细胞观察推测，双核期的花粉中开始积累淀粉，不能使花粉发育成植株。通常采用醋酸洋红或碘化钾染色，再压片镜检，以确定花粉的发育时期。但是接种前不可能把所有的花粉都进行一次发育时期的镜检，通常是按照花蕾长度大小与花粉发育年龄的相关性，在实际操作中取一定大小的花蕾进行的。如水稻选择剑叶叶枕抽出距下一叶，叶枕约为4～6cm的孕穗稻。

 1.2培养基的选择

花药培养所采用的培养基是MS、N6、B5等。添加的激素有6-BA、KT和玉米素， 2.4-D，NAA和IAA等。诱导愈伤组织的培养基可添加2.4-D，其浓度为1～3mg/l，分化培养基可添加2～3mgBA，再加少许的IAA（0.2～0.5mg/l），生根培养基可单独添加生长素（0.5～ 1mg/l）。

基本培养基中的蔗糖浓度对花粉的诱导生长有一定作用。在辣椒花药培养中以6%的蔗糖浓度对胚状体的诱导率为最高。

 1.3消毒接种培养

花药消毒，从健壮无病植株采集花蕾，因为未开放的花蕾中的花药为花被包裹，本身处于无菌状态，可仅用70%酒精棉球将花的表面擦洗即可。也可按对其它器官消毒处理方法进行，先用70%的酒精浸一下后，在饱和漂白粉溶液中浸10～20min，或用0.1%升汞液消毒7～10min，然后用无菌水洗3～5次。

消毒前预处理，将花蕾剪下放入水中，在冰箱4～5℃下保持3～4天。低温贮藏后，花药容易发生胚状组织。接种时把花蕾用解剖刀、镊子小心剥开，取出花药，注意去掉花丝，然后散落接种到培养基上，一个10ml的试管可接种20个花药。

培养条件：培养温度在23～28℃左右，每天11～16h的光照，光照强度2000～4000lx。

培养历程：脱分化培养时，可用MS+2.4－D的培养基，或N6+2.4－D的培养基，经10～30天，可诱导生成愈伤组织，或少数生成胚状体。愈伤组织增殖到1～3mm左右时，应转移到加有细胞分裂素和微量生长素的新的分化培养基上，再经20～30天，可获花粉植株。

1.4花药培养中的花粉发育过程

①营养细胞发育途径

在花药离体培养中，花粉第一次有丝分裂形成不均等的营养核和生殖核。生殖核较小，一般不分裂或只分裂1～2次，就逐步退化。而体积大的营养核经多次分裂且形成了细胞壁，最后变成了多细胞团，迅速生长，很快实破细胞壁，细胞不断分裂，可以产生胚状体或愈伤组织。

 ②生殖细胞发育途径

在这种途径下，营养核只分裂1～2次就退化了，而生殖核经多次分裂发育成多细胞团。

 ③营养细胞和生殖细胞同时发育的途径

 花粉第一次有丝分裂形成的营养核和生殖核同时进行多次分裂，因此最后形成的多细胞团包括两部分，一部分细胞较大的是由营养细胞分裂而来；另一部分细胞较小的是由生殖细胞分裂而来。

 ④花粉均等分裂途径

 花粉进行均等分裂形成两个均等的子核，以后二核间产生壁，形成两个子细胞，由两个子细胞形成多细胞团，迅速生长，穿破药壁而形成胚状体或愈伤组织。