1．了解稀释法分离土壤微生物的原理。

2．学习并掌握由土壤分离细菌和真菌的方法。

3，掌握有目的分离有益微生物的原理和技术。

原理

土壤是微生物栖居的大本营，各种各样的微生物都杂居在一起。当我们需要某种微生物时，即可通过提供适宜的营养条件，或添加只利于所需菌生长而抑制其它菌生长的抑制剂，有选择地将所需菌分离出来，这种技术即称为微生物的分离与纯化。稀释法常用于分离土壤、各种水域及基物表面的微生物。其原理是：先将土壤样品进行一系列倍比稀释，然后将几个适当浓度的稀释液均匀涂布于分离培养基表面。经培养后，土壤中的单个微生物细胞或孢子即可在培养基表面形成肉眼可见的菌落。再将所需菌落转入试管斜面,然后经平板划线再次取得单菌落后，即可得到所需菌种的纯菌株。因此，本方法的最大特点是可以对土壤样品进行活菌计数，同时，如果采用选择性培养基，可以分离到目的菌株。其全过程见图24-1。

本方法分离土壤微生物具有一定的局限性，首先，由于采用平板培养，绝对厌氧的微生物不宜在平板上生长，如果需要分离厌氧微生物，还需要厌氧操作装置。其次，采用的几种培养基不一定能适于土壤中所有的微生物生长，特别是那些目前尚不能在人工培养基上生长的微生物。本实验选择细菌、放线菌和真菌的最适培养基，对各大类微生物进行分离和活菌计数。

本实验还针对可以产生纤维素酶的微生物而设计了选择性分离培养基。分别根据分离目的设计出相应的筛选模型。制备含有不同底物的培养基平板，将稀释的土壤悬液涂布，或将分离到的菌株直接点接在选择性平板表面，置适宜温度培养后，可通过肉眼观察来判断目的需要的目的菌株。

材料

1．样品：过筛（孔径约2mm）的新鲜土壤样品（使用前先测定含水量）。

2．培养基：在300ml 三角瓶中分别分装150ml 牛肉膏蛋白胨培养基、马铃薯葡萄糖培养基和高氏1 号培养基。

3．选择性培养基：纤维素酶产生菌分离培养基 （选做）

4．灭菌物品：250ml 三角瓶分装90ml 无菌水（内含20-30 粒玻璃珠），18×180mm 试管分装9ml 无菌水，培养皿，1ml 吸管，玻璃刮铲。

方法

1．制备土壤稀释液：用小天平称分别称取少时潮湿的菜园土和风干的菜园土各10g，置于90ml 含玻璃珠的无菌水中，震荡10min，静置30 秒后，即得土壤原液（10－1）。再用1ml 无菌吸管吸取1ml 上清液加到9ml 无菌水中，充分摇匀，即得（10－2）稀释液。依次类推，潮湿土制得10－1 至10－6 稀释液； 风干土制备10－1 至10－4 稀释液；

2．分离：

（1）细菌的分离（基内接种）

a.．取9 个无菌平皿，用1ml 无菌吸管分别吸取0.1ml 10－4、10－5 及10－6 潮湿土的土壤稀释液，接入平皿，每一稀释度设3 个重复，

b．将已融化并冷却至45℃左右的细菌培养基倒入无菌培养皿中，每皿约15ml，共9 个平皿，与菌液充分混匀，凝固后，在平皿上作好培养基种类、稀释度、组号及日期标记；

c．将平板倒置，37℃培养2~3 天后观察并计数。

（2）放线菌的分离（表面接种）

a．将已融化的150ml 高氏一号培养基中加入2 滴10%重铬酸钾溶液，充分混匀后倒入无菌培养皿中，每皿约15ml，共9 个平皿，凝固后，在平皿上作好培养基种类、稀释度、组号及日期标记；

b．用1ml 无菌吸管分别取0.1ml 10－3、10－4 及10－5 风干土的土壤稀释液，接入培养基表面，每一稀释度3 个重复；

c．用无菌玻璃刮铲，按稀释度由高到低顺序依次轻轻涂布，不要刮破培养基表面；

d．将平板倒置，37℃培养5~7 天后观察并计数。

（3）真菌的分离（表面接种）

a．将已融化的150ml PDA 培养基冷却到50℃左右，加入0.3ml 链霉素溶液（1000/ml），充分混匀后倒入无菌培养皿中，每皿约15ml，共9 个平皿，凝固后，在平皿上作好培养基种类、稀释度、组号及日期标记；

b．用1ml 无菌吸管分别取0.1ml 10－3、10－4 及10－5 潮湿土的土壤稀释液，接入培养基表面，每一稀释度3 个重复；

c．用无菌玻璃刮铲按稀释度由高到低顺序依次轻轻涂布，不要刮破培养基表面；

d．将平板倒置，26℃~28℃培养3 天后观察并计数。

结果

1．活菌计数：

计数时通常选用每种微生物生长的最适稀适度的三个平皿计数， 如细菌、放线菌和酵母菌以每皿30~300 个菌落为宜，丝状真菌则以每皿10~100 个菌落为宜。将原始结果填入下表，根据事先测定的土壤含水量，按公式计算出每个干土中微生物的量。

2．检查每皿中的优势菌种，可根据菌落特征、制水压片、染色制片等观察菌体形态；

3．纯培养：记录优势菌株的菌落特征并编号，然后将其划线接入试管斜面。根据已掌握的知识进行判断，细菌用牛肉膏蛋白胨培养基，放线菌用高氏一号培养基，真菌用PAD培养基。见图24-3。分别在相应培养基平板上划线分离单菌落，待长好后再次划线接入试管斜面，以备鉴定、保存使用。