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1 范围
本标准规定了出口食品中产气荚膜梭状芽孢杆菌的计数检验方法。
本标准适用于出口食品中产气荚膜梭状芽孢杆菌的检验。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
SN/T 1538.1 培养基制备指南 第1部分：实验室培养基制备质量保证通则
SN/T 1538.2 培养基制备指南 第2部分：培养基性能测试实用指南3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件
3 术语及定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
产气荚膜梭状芽孢杆菌
在特定的选择性培养基上，细菌菌落生长呈现黑色特点（亚硫酸盐降解为硫化物而形成黑色沉淀物，并使菌落呈现黑色），分解乳糖产酸产气，48ｈ内能液化明胶的细菌。
4 设备和材料
4.1 无菌吸管：1.0ｍＬ 和10.0ｍＬ，分刻度分别为0.1ｍＬ 和1.0ｍＬ。
4.2 无菌培养皿：直径90ｍｍ。
4.3 均质器及均质袋（或均质杯）。
4.4 恒温培养箱或厌氧培养箱：37℃±0.5 ℃。
4.5 恒温水浴锅：46 ℃±0.5 ℃。
4.6 厌氧发生装置。
4.7 放大镜和（或）菌落计数器。
4.8 光学显微镜10×～100×。
4.9 冰箱：2 ℃～8 ℃。
4.10 天平：感量0.1ｇ。
4.11 全自动微生物鉴定系统。
５ 培养基和试剂
除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为GB／T 6682规定的分析实验室用水。
5.1 亚硫酸盐环丝氨酸琼脂（SC）：见Ａ．１。
5.2 液体硫乙醇酸盐培养基：见Ａ．２。
5.3 乳糖亚硫酸盐培养基（LS）：见Ａ．３。
5.4 缓冲动力硝酸盐培养基：见Ａ．４。
5.5 亚硝酸盐检测试剂：见Ａ．５。
5.6 锌粉。
5.7 乳糖明胶培养基：见Ａ．６。
5.8 蛋白胨水：见Ａ．７。
5.9 ＶＩＴＥＫ２ＡＮＩ生化鉴定卡。
6 检验程序
产气荚膜梭状芽孢杆菌检验程序见图
7 操作步骤
7.1 样品的稀释
7.1.1 无菌操作称取检样25ｇ（ｍＬ）放入无菌均质器或均质袋中，加入225 ｍＬ 蛋白胨水，均质，制成1∶10样品匀液。
7.1.2 吸取1∶10样品匀液1ｍＬ，加入到9ｍＬ 蛋白胨水中，混合均匀，制成1:100样品匀液。必要时，按此法将样品作进一步的10倍递增稀释。
7.2 接种与培养
7.2.1 选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），每个稀释度分别吸取1ｍＬ 样品匀液加入到两个无菌平皿内。
7.2.2 将10ｍＬ～15ｍＬ 维持在44 ℃～47 ℃的SC琼脂倾注平皿，转动平皿使其混合均匀。待培养基凝固后，再覆盖上10ｍＬSC琼脂，待其完全凝固。
7.2.3 翻转平板，放入厌氧罐或其他适宜容器中，厌氧环境下37℃±0.5 ℃下培养20ｈ±2ｈ。培养时间过长可能会导致平板颜色过黑。
7.3 平板计数
7.3.1 选取菌落数＜150ＣＦＵ 的平板，计数每个平板上的黑色菌落数，记录稀释倍数。
7.3.2 每个平板挑取５个典型或可疑菌落（小于５个时应全部挑选）进行确证。
7.4 乳糖亚硫酸盐试验确证
7.4.1 接种
将SC 琼脂上的典型或可疑菌落接种到液体硫乙醇酸盐培养基中，厌氧环境下37℃±0.5 ℃下培养18ｈ～24ｈ。以无菌吸管移取硫乙醇酸盐培养物5滴加入到乳糖亚硫酸盐（LS）培养基中。46 ℃水浴中需氧条件下培养18ｈ～24ｈ。
7.4.2 观察
观察倒管内有否气泡产生及试管底部是否变黑（亚硫酸铁沉淀），若倒管中四分之一以上充满气体并且有黑色沉淀物则可判定为阳性。当倒管中产生的气体不足四分之一时，立即以无菌吸管从先前的ＬＳ培养基中吸取5滴加到另一LS培养基试管中，46℃水浴培养18ｈ～24ｈ，再次观察结果。
7.4.3 判读
在SC 培养基中形成黑色菌落，同时LS培养基中反应阳性的细菌，可确认为产气荚膜梭状芽孢杆菌，除此之外应视为阴性。
7.5 动力硝酸盐试验和乳糖明胶液化试验确证
7.5.1 纯化
7.5.2 接种
将挑取的纯菌落分别穿刺接种缓冲动力硝酸盐培养基和乳糖明胶培养基，厌氧条件下37℃ ±0.5 ℃培养24ｈ。
7.5.3 动力硝酸盐试验观察
在透射光下检查缓冲动力硝酸盐培养基试管中细菌沿穿刺线生长情况，有动力的菌株沿着穿刺线呈扩散生长；没有动力的菌株，仅沿穿刺线生长。分别加0.5ｍＬ 试剂甲与0.2ｍＬ 试剂乙于缓冲动力硝酸盐培养基中以检查亚硝酸盐的存在。出现橙红色者，表明有菌株将硝酸盐还原成了亚硝酸盐。若15ｍｉｎ内未出现颜色变化，则添加少许金属锌粉，放置10ｍｉｎ。如果加锌粉后出现橙红色，表明菌株不能还原硝酸盐。若出现微弱的亚硝酸盐反应（如：浅粉色）则应排除，因为产气荚膜梭状芽孢杆菌的反应比较剧烈而且迅猛。
7.5.4 乳糖明胶试验观察
发现产气和培养基变黄色，表明乳糖发酵并产酸。将试管置5℃冷却1ｈ，检查明胶液化情况。若培养基仍为固态，则需37 ℃±0.5 ℃再培养24ｈ，再次检查明胶是否液化。
7.5.5 判读
在SC 琼脂上形成黑色菌落，无动力的，通常会将硝酸盐还原为亚硝酸盐，分解乳糖产酸产气，48ｈ内能液化明胶的细菌，确认为产气荚膜梭状芽孢杆菌。
7.6 自动微生物鉴定系统确证
将SC 琼脂上的典型或可疑菌落接种到液体硫乙醇酸盐培养基中，厌氧条件下37℃±0.5 ℃培养18ｈ～24ｈ，划线接种SC琼脂平板，再覆盖上10ｍLSC琼脂。待其完全凝固后，厌氧条件下37℃±0.5℃培养18ｈ～24ｈ，获得纯培养菌落。如有必要，可重复上述步骤，以获得完全分离的，典型的黑色菌落。
如选择VITEK compact，可从SC平板上挑选可疑菌落，用生理盐水制成浊度适当的菌悬液，使用VITEK compact全自动微生物鉴定系统进行鉴定。
7.7 判定
任何符合7.4.3或者7.5.5的判读确证或者经7.6的鉴定为产气荚膜梭状芽孢杆菌的菌落，确认为产气荚膜梭状芽孢杆菌。
8 结果报告
样品中产气荚膜梭状芽孢杆菌的计数，基于被证实为产气荚膜梭状芽孢杆菌菌落的百分数。
例如：10-4稀释的平板中，平均有85个菌落，由2个平板上选取的10个菌落中，有8个被证实为产气荚膜梭菌，那么每克食品中产气荚膜梭状芽孢杆菌数，即为85×（8／10）×10000＝680000CFU。
根据计算结果报告检样中产气荚膜梭状芽孢杆菌数／g（ml）。
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