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本次培养基使用疫苗专用BHI为例

1.制备固体平板

  ①准备工作：取BHI疫苗专用培养基肉汤，按10 g（琼脂）/L（水+马血清）用量添加琼脂。灭菌结束后，为防止培养基过热致使添加血清后使血清变质，添加血清前将培养基冷却至50℃左右。为防止血清过冷致使培养基凝固，添加血清前将血清预热至37℃。血清一般在冰箱冷冻保存，取出后需预热至37℃后使用

  ②添加抑菌剂：抑菌剂使用青霉素钠，青霉素钠用量为80万IU/L（900 mL水+100 mL马血清），青霉素钠溶液货号为HB7025-2a。

  ③添加血清及制备平板：添加血清且摇匀后，此时会产生大量泡沫，若直接倒板平板表面会布满气泡，严重干扰试验结果的观察，使用移液枪（10 mL灭菌后的枪头）每板吸加20 mL，此后，风吹15分钟，备用。

2.菌液梯度稀释

  使用BHI疫苗专用培养基肉汤作为稀释液，将人肺炎支原体原液梯度稀释至10-3。

3.涂布接种

  吸取100 μL菌液（原液~10-3共4个浓度）涂布至固体平板，接100 μL BHI肉汤至平板作为阴性对照，使用封口膜对平板封口，平行组数为3。

4.培养

  放置于36℃培养箱中培养21天。

5.结果观察 

  取平板观察，平板由橙红（阴性对照）变黄（阳性），且在光线下可见平板表面有微小菌落，初步判定阳性结果。将平板放置于低倍镜下观察，可见煎鸡蛋状菌落，核心部分较厚，向下长入培养基，周边一层薄的透明颗粒区，可判定阳性结果。

6.补充-染色镜检

  为增加颜色对比度，可采用染色镜检。将结晶紫染液稀释10倍左右，直接加入到平板上染色10秒，可不用水冲洗，将平板放置于显微镜下观察。（注：染色结束后，若用水冲洗可能会将菌落冲掉，这与菌落在平板表面的附着力有关）