1、第一次选择性增菌

  以无菌操作称取25 g样品,放入装有225 mL灭菌APW增菌液的均质袋内，均质1 min~2 min，或以剪刀充分剪碎，制成1:10样品匀液。深冻样品、干品、盐渍产品的初始增菌液放置在37℃±1℃培养6 h±1 h，新鲜样品的初始增菌液放置在41.5℃±1℃培养6 h±1 h。

  如果样品不够25 g，则取全部样品，加入9x mL增菌液以获得10-1浓度的样品匀液。

  如果上述制备的待检样品不能够在当日进行培养，应放置在2℃~8℃保存至次日。

  注：加入样品前，APW应预先保温至37℃±1℃

2、第二次选择性增菌

  取1 mL APW培养物接种到10 mL的APW中，置于41.5℃±1℃培养 18 h±1 h。

3、分离

  分别用直径为3 mm的接种环从1和2的APW增菌液中蘸取一接种环，划线接种TCBS琼脂和弧菌显色培养基平板上以分离菌落。在37℃±1℃培养箱中，将平板倒置培养。

  经过24 h±3 h培养后，检查平板有无可疑菌落。在平板的背面标记可疑菌落。霍乱弧菌在TCBS上的可疑菌落形态为：表面光滑，黄色，直径约为2 mm~3 mm。

  霍乱弧菌在弧菌显色培养基上为紫红色菌落。

4、鉴定

（1）选择可疑菌落并纯化菌落

  至少应挑取5个可疑菌落，进行传代培养。如果平板上的可疑菌落少于5个，则应该全部挑取传代培养。

  注：食品，特别是海产品，可能含有大量的细菌，包括其他孤菌，这些菌可在选择性培养阶段生长。若在传代培养阶段选择的菌落太少，则可造成目标致病菌的漏检。

  在氯化钠营养琼脂平板或试管斜面接种单个可疑菌落进行传代培养以获得纯培养物。在37℃±1℃培养箱中培养24 h±3 h。

  对氯化钠营养琼脂上的纯培养物进行鉴定。

（2）初步鉴定

 1.显微镜下检验

  a)革兰氏染色试验：霍乱弧菌为革兰氏染色阴性，无芽孢，弧形或弯曲状；

  b)动力试验： 用接种针挑取培养物穿刺接种于半固体琼脂中，37±1℃培养24 h±3 h。霍乱弧菌沿穿刺线呈扩散生长。

 2.氧化酶试验

  将氧化酶试纸用约 10 μL～20 μL蒸馏水润湿，用细玻璃棒或一次性塑料接种环(针)挑取单个菌落涂抹在试纸上(若菌落本身比较湿润，也可不必润湿试纸，直接涂抹菌落)。在30 s内变为蓝色或蓝紫色为阳性，不变色为阴性。霍乱弧菌氧化酶为阳性。

 3.氯化钠三糖铁试验

  接种氯化钠三糖铁斜面，穿刺底层并划线斜面。37℃±1℃培养箱中培养24 h±3 h。

  反应结果解释如下：

  a）琼脂底层

   1）黄色：葡萄糖发酵反应阳性（发酵葡萄糖）；

   2）红色或者未变色：葡萄糖发酵反应阴性（不发酵葡萄糖）；

   3）黑色：产生硫化氢；

   4）产生气泡或者培养基爆裂:葡萄糖发酵产气。

  b）琼脂斜面

   1）黄色：乳糖或蔗糖阳性（利用乳糖或蔗糖）；

   2）红色或者未变色：乳糖或蔗糖阴性（不利用乳糖或蔗糖）；

   3）可疑的霍乱弧菌在氯化钠三糖铁斜面上的反应为底层黄色,斜面黄色，不产生硫化氢，不产气。培养应不超过24 h（斜面的黄色可能在24 h后变为红色）。

 4.生化测试菌株选择

  选择革兰氏染色阴性，运动性阳性，氧化酶阳性，氯化钠三糖铁试验符合霍乱弧菌特性的菌落在氯化钠营养琼脂平板或试管斜面纯化后，进行生化确认。